Não há uma plataforma de imagem de células T do receptor quimérico validado clinicamente até o momento. O symporter de iodeto de sódio representa um repórter sensível e clinicamente relevante para a imagem células T por PET scan. TLP PET imagem de CÉLULA T NIS permite que os pesquisadores rastreiem invasivamente células infundidas in vivo e tem potencial para prever eficácia e toxicidade da terapia car t-cell.
A imagem eficiente das células CAR T permite a avaliação do tráfico e expansão de células T e permite o desenvolvimento de estratégias para superar as limitações. O método descrito neste protocolo é simples e pode ser aplicado a outras construções car além das mostradas neste estudo. Comece com o isolamento de células mononucleares periféricas ou PBMCs da amostra de sangue usando a técnica de gradiente de densidade padrão.
Para isso, adicione suavemente 15 mililitros de média gradiente de densidade a um tubo de separação de gradiente de densidade de 50 mililitros evitando a formação de bolhas. Para evitar a captura celular, diluir a amostra de sangue com PBS contendo 2% de FBS em uma proporção de volume de um para um e transferir suavemente o sangue diluído em cima do meio de gradiente de densidade sem quebrar a interface entre os dois. Em seguida, centrifugar o tubo de separação a 1.200 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente.
Colete o supernatante em um tubo cônico fresco de 50 mililitros, lave as células com PBS contendo 2%FBS preenchendo o tubo até 50 mililitros e centrifugando o tubo a 300 vezes G por oito minutos à temperatura ambiente. Aspire o supernaente antes de reutilizar as células pelleted em 50 mililitros de PBS contendo 2%FBS. Resuspenha os PBMCs pelleted em PBS contendo 2%FBS a uma concentração de 50 vezes 10 a sexta células por mililitro.
Repita a lavagem em um tubo fresco de 50 mililitros. Conte o número de células e, em seguida, centrifugar a suspensão celular a 300 vezes G por oito minutos à temperatura ambiente. Para isolamento de células T, transfira PBMCs isolados para um tubo inferior redondo de poliestireno de 14 mililitros.
Em seguida, use um kit de contas magnéticas de seleção negativa para realizar o isolamento de células T colocando os PBMCs em coquetel de anticorpos de seleção negativa em um separador de células totalmente automatizado. Após o isolamento das células T, conte as células e cultue as células em meio de expansão de células T ou TCM em uma concentração de duas vezes 10 a sexta células por mililitro. Em seguida, misture o frasco contendo as contas anti-CD3/CD28 girando e pipeta para fora o volume necessário de contas em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mililitro estéril.
Para lavar, resuspense as contas em um mililitro de TCM antes de colocar tubo em um ímã por um minuto e aspirar o supernasce. Depois de remover o tubo do ímã, resuspenja as contas lavadas em um mililitro de TCM e repita a lavagem duas vezes. Resuspende as contas lavadas em um mililitro de TCM para transferi-las para a cultura das células T, em seguida, diluir a suspensão de contas de células T com TCM para uma concentração de 1,0 vezes 10 para a sexta células por mililitro antes de transferi-lo para uma cultura de tecido tratada com placa de seis poços.
Incubar a placa do poço a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para progredir com a transdução de lentivírus, descongele os lentivírus congelados no revestimento de receptores de antígeno quimérico ou symporter de iodeto de sódio a quatro graus Celsius. Após 24 a 48 horas de estimulação de células T, misture as células T para quebrar os aglomerados e adicione o lentivírus recém-descongelado às células em uma multiplicidade de infecção de cinco.
Incubar as células T transduzidas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Nos dias três, quatro e cinco de incubação, conte as células T transduzidas e ajuste a concentração celular para 1,0 vezes 10 para a sexta célula por mililitro adicionando TCM pré-aquecido fresco. Para as células T transduzidas pelo NIS que carregam o gene de resistência à puramicina, trate as células com um micrograma por mililitro de dihidrocloreto de diomicina nos dias três, quatro e cinco.
No sexto dia, desmembre os aglomerados de células T e remova as contas anti-CD3/CD28 das células T transduzidas colocando a placa em um ímã por um minuto. Em seguida, coloque as células coletadas de volta na cultura em uma concentração de 1,0 vezes 10 para a sexta células por mililitro. Lave uma alíquota da cultura t-cell contendo 50.000 células com tampão de fluxo e resuspenque as células com 50 microliters de tampão de fluxo.
Para detectar a expressão CAR, colorija as células T com um microliter de anticorpo anti-rato de cabra. Para excluir as células mortas, adicione 0,3 microliters de LIVE/DEAD Aqua. Incubar as células manchadas no escuro à temperatura ambiente.
Após 15 minutos, lave as células com 150 microliters de tampão de fluxo a 650 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius. Para corrigir e permeabiliizar as células manchadas, incubar as células com 100 microliters de meio de fixação por 20 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células duas vezes com 100 microliters de um tampão contendo um agente permeabilizante celular, como saponina e centrífuga.
Após a lavagem, resuspenja as células permeabilizadas em 50 microlitres de um tampão permeabilizante. Em seguida, adicione 0,3 nanogramas de anticorpo ETNL NIS anti-humano e incubar a quatro graus Celsius. Após uma hora de incubação, lave as células adicionando 150 microliters de tampão de fluxo e centrífuga como demonstrado.
Em seguida, incubar as células com 50 microliters de tampão de fluxo contendo 2,5 microliters de anticorpo secundário anti-coelho por 30 minutos a quatro graus Celsius. Depois de lavar as células T como demonstrado, resuspenco as células em 200 microliters de tampão de fluxo para realizar a citometria de fluxo. Em seguida, determine a eficiência de transdução das células.
No oitavo dia, conte e gire as células T a 300 vezes G por oito minutos a quatro graus Celsius antes de reutilizar a pelota celular com um meio de congelamento em uma concentração de 10 vezes 10 a sexta células por mililitro. Transfira um mililitro da suspensão celular para cada frasco criogenado rotulado para armazenar a menos 80 graus Celsius congelador por 48 horas. Depois de 48 horas, transfira as células T para nitrogênio líquido.
Prepare os camundongos injetados com células T BMA CAR positivas do NIS para a imagem PET/CT pesando os ratos e removendo as etiquetas de ouvido metálicas. Em seguida, injete 9,25 megabecquerel de tetrafluoroborato F18 recém-preparado no mouse por via intravenosa por injeção de veia traseira. Após 45 minutos de período de captação, proceda à aquisição de imagens estáticas pet de um mouse anestesiado por 15 minutos, seguido de aquisição de imagem CT por cinco minutos com rotação de 360 graus e 180 projeções.
Nesta análise representativa, a co-transdução de dois vírus em células T gerou células T positivas do NIS, onde mais de 90% das células eram NIS positivas. A análise da cinética de crescimento de células T de zero a oito dias revelou que a incorporação do BCMA CAR e DO NIS não impactou significativamente a expansão das células T quando comparada às células não traduzidas. Na análise citométrica de fluxo de OPM-2, as células transduzidas com lentivírus representaram a expressão GFP após o tratamento com puramicina.
Os camundongos que receberam células OPM-2 positivas da BCMA foram submetidos a imagens de bioluminescência para confirmar o engrafamento das células OPM-2. Imagens PET do camundongo administrado por tetrafluoroborato F18 revelaram a distribuição positiva de células T do NIS BCMA CAR nos vários órgãos e medula óssea. Além disso, as células de medula óssea colhidas do camundongo apresentaram o engrafamento das células OPM-2 e a entrega das células T do BCMA CAR positivos do NIS para a medula óssea.
Para imagens de alta qualidade de células CAR T infundidas, é importante seguir os passos do protocolo de geração de células T DO NIS CAR e confirmar a presença de frações positivas DE NIS e CAR duplas.
