使用[^18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描对嵌合抗原受体T细胞进行动态成像

迄今为止，尚无临床验证的嵌合抗原受体T细胞成像平台。碘化钠共排剂代表了通过PET扫描对Car T细胞进行成像的敏感和临床相关的报告基因。NIS CAR T细胞的TLP PET成像使研究人员能够非侵入性地跟踪体内输注细胞，并有可能预测CAR T细胞疗法的疗效和毒性。

CAR T细胞的有效成像可以评估T细胞的运输和扩增，并允许制定克服局限性的策略。该协议中描述的方法很简单，可以应用于本研究中显示的CAR结构以外的其他CAR结构。首先使用标准密度梯度技术从血液样本中分离外周血单核细胞或PBMC。

为此，将15毫升密度梯度培养基轻轻加入50毫升密度梯度分离管中，避免形成气泡。为避免细胞捕获，以一比一的体积比用含有2%FBS的PBS稀释血液样品，并将稀释的血液轻轻地转移到密度梯度培养基的顶部，而不会破坏两者之间的界面。然后将分离管在室温下以1，200倍G离心10分钟。

将上清液收集到新鲜的50毫升锥形管中，通过填充管至50毫升标记，用含有2%FBS的PBS洗涤细胞，并在室温下以300倍G离心管8分钟。吸出上清液，然后将沉淀的细胞重悬于含有2%FBS的50毫升PBS中。将含有2%FBS的PBS中重悬沉淀的PBMC至浓度为每毫升10至第六个细胞的50倍。

在新鲜的50毫升管中重复洗涤。计算细胞数量，然后在室温下以300倍G离心细胞悬浮液8分钟。对于T细胞分离，将分离的PBMC转移到14毫升聚苯乙烯圆底管中。

然后使用阴性选择磁珠试剂盒，通过将PBMC置于全自动细胞分离器中的阴性选择抗体混合物中来执行T细胞分离。T细胞分离后，计数细胞并在T细胞扩增培养基或TCM中以每毫升10至第六个细胞的浓度培养细胞。接下来，通过旋转将含有抗CD3 / CD28微珠的小瓶混合，并将所需体积的微珠移出到无菌的1.5毫升微量离心管中。

洗涤时，将珠子重悬于一毫升中药中，然后将管子放在磁铁上一分钟并吸出上清液。从磁铁上取下管子后，将洗涤的珠子重悬于一毫升中药中，并重复洗涤两次。将洗涤的珠子重悬于一毫升中药中以将其转移到T细胞培养物中，然后用中药将T细胞珠悬浮液稀释至每毫升10至第六个细胞的浓度，然后将其转移到组织培养处理的六孔板中。

将孔板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。为了随着慢病毒的转导而进展，在4摄氏度下解冻涂层嵌合抗原受体或碘化钠共转子中的冷冻慢病毒。经过24至48小时的T细胞刺激后，混合T细胞以分解簇，并将新鲜解冻的慢病毒以5的多重感染率加入细胞中。

在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育转导的T细胞。在孵育的第3天，第4天和第5天，计数转导的T细胞，并通过加入新鲜的预热中药将细胞浓度调节至每毫升10至第六个细胞的1.0倍。对于携带嘌呤霉素耐药基因的NIS转导T细胞，在第三天，第四天和第五天用每毫升盐酸嘌呤霉素一微克处理细胞。

在第六天，将板放在磁铁上一分钟，分解T细胞簇并从转导的T细胞中取出抗CD3 / CD28珠子。然后将收集的细胞以每毫升10至第六个细胞的浓度放回培养物中。用流动缓冲液洗涤含有50， 000个细胞的T细胞培养物的等分试样，并用50微升流动缓冲液重悬细胞。

为了检测CAR表达，用一微升山羊抗小鼠抗体染色T细胞。为了排除死细胞，加入0.3微升活/死水。在室温下在黑暗中孵育染色的细胞。

15分钟后，用150微升流动缓冲液在650倍G下洗涤细胞，在4摄氏度下洗涤细胞三分钟。为了固定和透化染色的细胞，用100微升的固定培养基在4摄氏度下孵育细胞20分钟。然后用含有细胞透化剂（如皂苷）的100微升缓冲液洗涤细胞两次，然后离心机。

洗涤后，将透化细胞重悬于50微升的透化缓冲液中。然后加入0.3纳克抗人ETNL NIS抗体，在4摄氏度下孵育。孵育一小时后，通过加入150微升流动缓冲液和离心机洗涤细胞，如图所示。

然后用含有2.5微升抗兔二抗的50微升流动缓冲液孵育细胞，在4摄氏度下孵育细胞30分钟。如图所示洗涤T细胞后，将细胞重悬于200微升流动缓冲液中以进行流式细胞术。然后确定细胞的转导效率。

在第八天，在4摄氏度下以300倍G计数并旋转T细胞8分钟，然后用浓度为10倍10至每毫升第六个细胞的冷冻培养基重悬细胞沉淀。将一毫升细胞悬浮液转移到每个标记的冷冻小瓶中，在零下80摄氏度的冰箱中储存48小时。48小时后，将T细胞转移到液氮中。

通过称量小鼠并取出金属耳标，准备注射NIS阳性BCMA CAR T细胞的小鼠进行PET / CT成像。然后通过尾静脉注射将新鲜制备的F18四氟硼酸盐的9.25兆贝克勒注射到小鼠体内。在摄取期45分钟后，继续采集麻醉小鼠的静态PET图像15分钟，然后以360度旋转和180次投影采集5分钟的CT图像。

在这项具有代表性的分析中，两种病毒共转导为T细胞产生了NIS阳性BCMA CAR T细胞，其中超过90%的细胞为NIS阳性。对从0天到8天的T细胞生长动力学的分析表明，与未转译的细胞相比，BCMA CAR和NIS的掺入对T细胞的扩增没有显着影响。在OPM-2的流式细胞术分析中，用慢病毒转导的细胞在用嘌呤霉素处理时代表GFP表达。

接受BCMA阳性荧光素酶阳性OPM-2细胞的小鼠进行生物发光成像以确认OPM-2细胞的植入。F18四氟硼酸盐给药小鼠的PET成像显示NIS阳性BCMA CAR T细胞分布在各个器官和骨髓中。此外，从小鼠收获的骨髓细胞显示出OPM-2细胞的移植并将NIS阳性BCMA CAR T细胞递送到骨髓。

对于输注的CAR T细胞的高质量成像，重要的是要遵循NIS CAR T细胞生成方案的步骤，并确认是否存在双NIS和CAR阳性组分。