Il n’existe à ce jour aucune plateforme d’imagerie des lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique validée cliniquement. Le symporteur d’iodure de sodium représente un rapporteur sensible et cliniquement pertinent pour imager les cellules Car T par TEP. L’imagerie TEP TLP des cellules CAR T NIS permet aux chercheurs de suivre de manière non invasive les cellules infusées in vivo et a le potentiel de prédire l’efficacité et la toxicité de la thérapie par cellules CAR-T.
L’imagerie efficace des cellules CAR-T permet l’évaluation du trafic et de l’expansion des cellules T et permet le développement de stratégies pour surmonter les limites. La méthode décrite dans ce protocole est simple et peut être appliquée à d’autres constructions CAR au-delà de celles présentées dans cette étude. Commencez par isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique ou les PBMC de l’échantillon de sang en utilisant la technique du gradient de densité standard.
Pour ce faire, ajoutez doucement 15 millilitres de milieu de gradient de densité à un tube de séparation de gradient de densité de 50 millilitres évitant la formation de bulles. Pour éviter le piégeage cellulaire, diluer l’échantillon de sang avec du PBS contenant 2% de FBS à un rapport de volume de un pour un et transférer doucement le sang dilué sur le milieu de gradient de densité sans rompre l’interface entre les deux. Ensuite, centrifugez le tube de séparation à 1 200 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.
Recueillir le surnageant dans un tube conique frais de 50 millilitres, laver les cellules avec du PBS contenant 2% de FBS en remplissant le tube jusqu’à 50 millilitres et en centrifugant le tube à 300 fois G pendant huit minutes à température ambiante. Aspirer le surnageant avant de remettre en suspension les cellules granulées dans 50 millilitres de PBS contenant 2% de FBS. Remettre en suspension les PBMC granulés dans des PBS contenant 2% de FBS à une concentration de 50 fois 10 à la sixième cellule par millilitre.
Répétez le lavage dans un tube frais de 50 millilitres. Comptez le nombre de cellules, puis centrifugez la suspension cellulaire à 300 fois G pendant huit minutes à température ambiante. Pour l’isolement des lymphocytes T, transférez les PBMC isolés dans un tube inférieur rond en polystyrène de 14 millilitres.
Utilisez ensuite un kit de billes magnétiques à sélection négative pour isoler les lymphocytes T en plaçant les PBMC dans un cocktail d’anticorps à sélection négative dans un séparateur de cellules entièrement automatisé. Après l’isolement des lymphocytes T, comptez les cellules et cultivez les cellules dans un milieu d’expansion des lymphocytes T ou MTC à une concentration de deux fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Ensuite, mélangez le flacon contenant les billes anti-CD3/CD28 en faisant tourbillonner et pipettez le volume requis de perles dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre.
Pour le lavage, remettez en suspension les billes dans un millilitre de MTC avant de placer le tube sur un aimant pendant une minute et aspirez le surnageant. Après avoir retiré le tube de l’aimant, remettez en suspension les billes lavées dans un millilitre de MTC et répétez le lavage deux fois. Remettre en suspension les billes lavées dans un millilitre de MTC pour les transférer dans la culture de lymphocytes T, puis diluer la suspension de billes de lymphocytes T avec de la MTC à une concentration de 1,0 fois 10 à la sixième cellule par millilitre avant de la transférer dans une plaque de six puits traitée par culture tissulaire.
Incuber la plaque du puits à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour progresser dans la transduction des lentivirus, décongeler les lentivirus congelés dans des récepteurs d’antigènes chimériques ou un symporteur d’iodure de sodium à quatre degrés Celsius. Après 24 à 48 heures de stimulation des lymphocytes T, mélangez les lymphocytes T pour briser les grappes et ajoutez le lentivirus fraîchement décongelé aux cellules à une multiplicité d’infection de cinq.
Incuber les lymphocytes T transductés à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Les troisième, quatrième et cinquième jours d’incubation, comptez les lymphocytes T transductés et ajustez la concentration cellulaire à 1,0 fois 10 à la sixième cellule par millilitre en ajoutant de la MTC fraîche préchauffée. Pour les lymphocytes T transduites par le NIS porteurs du gène de résistance à la puromycine, traitez les cellules avec un microgramme par millilitre de dichlorhydrate de puromycine aux troisième, quatrième et cinquième jours.
Le sixième jour, divisez les amas de lymphocytes T et retirez les billes anti-CD3/CD28 des lymphocytes T transductés en plaçant la plaque sur un aimant pendant une minute. Replacez ensuite les cellules collectées dans la culture à une concentration de 1,0 fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Laver une aliquote de la culture de lymphocytes T contenant 50 000 cellules avec tampon d’écoulement et remettre en suspension les cellules avec 50 microlitres de tampon d’écoulement.
Pour détecter l’expression de la CAR, colorez les lymphocytes T avec un microlitre d’anticorps anti-souris de chèvre. Pour exclure les cellules mortes, ajoutez 0,3 microlitre d’Aqua LIVE/DEAD. Incuber les cellules colorées dans l’obscurité à température ambiante.
Après 15 minutes, lavez les cellules avec 150 microlitres de tampon d’écoulement à 650 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Pour fixer et perméabiliser les cellules colorées, incuber les cellules avec 100 microlitres de milieu de fixation pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec 100 microlitres d’un tampon contenant un agent de perméabilisation cellulaire tel que la saponine et la centrifugeuse.
Après le lavage, remettre en suspension les cellules perméabilisées dans 50 microlitres d’un tampon perméabilisant. Ajoutez ensuite 0,3 nanogramme d’anticorps anti-humain ETNL NIS et incubez à quatre degrés Celsius. Après une heure d’incubation, lavez les cellules en ajoutant 150 microlitres de tampon d’écoulement et de centrifugeuse comme démontré.
Ensuite, incubez les cellules avec 50 microlitres de tampon d’écoulement contenant 2,5 microlitres d’anticorps secondaires anti-lapin pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé les lymphocytes T comme démontré, remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon d’écoulement pour effectuer une cytométrie en flux. Déterminez ensuite l’efficacité de transduction des cellules.
Le huitième jour, comptez et faites tourner les lymphocytes T à 300 fois G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius avant de réutiliser la pastille cellulaire avec un milieu de congélation à une concentration de 10 fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Transférer un millilitre de la suspension cellulaire dans chaque flacon cryogénique étiqueté pour le conserver au congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant 48 heures. Après 48 heures, transférer les lymphocytes T dans de l’azote liquide.
Préparez les souris auxquelles on a injecté des cellules CAR T BCMA POSITIVES AU NIS pour l’imagerie TEP/TDM en pesant les souris et en retirant les étiquettes d’oreille en métal. Injecter ensuite 9,25 mégabecquerels de tétrafluoroborate F18 fraîchement préparé dans la souris par voie intraveineuse par injection de veine caudale. Après 45 minutes de période d’absorption, procédez à l’acquisition d’images PET statiques d’une souris anesthésiée pendant 15 minutes, suivies d’une acquisition d’images CT pendant cinq minutes avec une rotation à 360 degrés et 180 projections.
Dans cette analyse représentative, la co-transduction de deux virus dans les lymphocytes T a généré des cellules CAR T BCMA POSITIVES au SNI où plus de 90 % des cellules étaient positives au SNI. L’analyse de la cinétique de croissance des lymphocytes T de zéro à huit jours a révélé que l’incorporation de BCMA CAR et de NIS n’avait pas d’impact significatif sur l’expansion des lymphocytes T par rapport aux cellules non transduites. Dans l’analyse cytométrique en flux d’OPM-2, les cellules transduites avec le lentivirus représentaient l’expression de GFP lors du traitement par puromycine.
Les souris recevant des cellules OPM-2 positives à la luciférase BCMA ont été soumises à une imagerie par bioluminescence pour confirmer la greffe de cellules OPM-2. L’imagerie TEP de la souris administrée au tétrafluoroborate F18 a révélé une distribution de cellules CAR T BCMA POSITIVE AU SNIS dans les différents organes et la moelle osseuse. De plus, les cellules de moelle osseuse prélevées sur la souris présentaient la greffe de cellules OPM-2 et l’administration des cellules CAR T BCMA POSITIVES au NIS dans la moelle osseuse.
Pour une imagerie de haute qualité des cellules CAR-T infusées, il est important de suivre les étapes du protocole de génération de cellules CAR T NIS et de confirmer la présence de fractions positives NIS et CAR doubles.
