שיטה זו יכולה להתבצע בכל מעבדה המצוידת לניסויים בתרביות תאים. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים לקדם את הבנתנו את התפתחות הכליות ואת מסלולי המחלה. זוהי שיטה פשוטה וזולה יחסית בהשוואה לאחרים לייצור אורגנואידים בכליות.
האתגר הגדול ביותר של טכניקה זו הוא שמירה על תרבית תאי גזע פלוריפוטנטית אנושית באיכות גבוהה. חשוב שהתאים יישמרו בפחות מ-80% מפגש ויתפצלו באופן קבוע. חוקרים חדשים בתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושית צריכים להכיר את קווי תאי הגזע לפני שהם ממשיכים להתמיינות.
התחילו את הבדיקה האורגנואידית של הכליה על ידי הוספת שני מיליליטרים של מדיום E5-ILP שלם לכל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד של שישה בארות. תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, או hPSCs, בצלחות שטופלו בתרבית רקמה של 100 מילימטר עד שהן מגיעות ל-60% מפגש. שטפו את ה-hPSCs פעמיים עם כשמונה מיליליטרים של DPBS.
שאפו ל-DPBS, ואז הוסיפו שני מיליליטרים של Dispase באופן טיפתי כדי לכסות את התאים, ודגרו אותם במשך שש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם כ 10 מיליליטרים של DPBS. שאפו ל-DPBS, ואז הטו את הצלחת ב-45 מעלות, ושפשפו את התאים כלפי מטה באמצעות מרים תאים.
שטפו את המושבות מלמעלה עם שישה מיליליטרים של מדיום E5-ILP שלם באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר. לאחר מכן, כשהם אוחזים בפיפטה אנכית, מפרקים מושבות גדולות על ידי צביעה עדינה למעלה ולמטה, תוך הקפדה שלא לגעת בצידי צלחת התרבות. פזרו את אשכולות המושבה באופן שווה על ידי הוספת מיליליטר אחד לכל באר לתוך הלוח בעל שש הבארות, ואז הניחו את הצלחת על שייקר מסלולי בתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
לחלופין, אם אין שייקר מסלולי זמין, התאים יכולים להיות בתרבית סטטית. ביום השני, לאחר שנתנו לגופים העובריים להתיישב בתחתית הצלחת, הטו את הצלחת ב-45 מעלות, ושאפו את המדיום באיטיות מלמעלה, תוך השארת מיליליטר אחד לכל באר. מוסיפים שני מיליליטרים של מדיום שלם מוכן לבאר, ומחזירים את הצלחת בחזרה לשייקר.
ביום השלישי, לאחר שאיפת המדיום כפי שהוכח בעבר, אספו את כל הגופים העובריים בזהירות מכל באר באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, והעבירו אותם לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. כדי לאסוף את כל הגופים העובריים הנותרים, יש לשטוף כל באר במיליליטר אחד של DMEM דל גלוקוז, והוסיפו אותם לאותה צינור חרוטי של 50 מיליליטר. בזמן ההמתנה שהגופים העובריים ישקעו בתחתית הצינור, הוסיפו שני מיליליטרים של מדיום שלב II לכל באר של צלחת ששת הבארות.
לאחר מכן, מסננים גופים עובריים גדולים על ידי הנחת מסננת תאים של 200 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר ומעבירים את כל הגופים העובריים בזהירות על מסננת התאים. שטפו את מסננת התאים בחמישה מיליליטרים נוספים של DMEM כדי לאסוף את כל הגופות העובריות שנתקעו במסננת. בשלבים מאוחרים יותר, השתמשו תחילה במסננת של 500 מיקרומטר כדי לסנן גופים עובריים גדולים מאוד, ולאחר מכן העבירו את התסיס דרך מסננת של 200 מיקרומטר כדי לסנן גופים עובריים קטנים מאוד ללא צינוריות.
אספו את הגופים העובריים בגודל הנכון, בין 200 ל-500 מיקרומטר, על ידי היפוך מסננת 200 מיקרומטר לצינור חדש של 50 מיליליטר ושטיפת המסננת עם DPBS. לאחר המאמץ, אפשרו לגופים העובריים להתיישב לתחתית הצינור החרוטי, ואז לשאוף את הסופרנאטנט, ולהתרחץ בכ-10 מיליליטרים של DMEM. לאחר מכן, החייאת הגופים העובריים בשישה מיליליטרים של מדיום שלב II.
מעבירים את הגופות העובריות בחזרה לתוך צלחת החיבור האולטרה-נמוכה בעלת שש הבארות, ומפיצים אותן באופן שווה בין הבארות. מכיוון שרוב האורגנואידים נאספים בחלק העליון של הפיפטה, משאירים כחצי מיליליטר בקצה, ואז נוגעים בעדינות בקצה המדיה בכל באר, ומאפשרים לאורגנואידים לזרום לתוך הבאר. מעבירים את הגופים העובריים לבקבוקון ספינר של 125 מיליליטר עם 45 מיליליטרים של מדיום שלב II.
כוונו את מהירות ההתעוררות המגנטית ל-120 סל"ד, והכניסו את הבקבוקון לחממה. כדי להאכיל את הגופים העובריים או האורגנואידים של הכליות, תנו להם להתיישב לזמן קצר לתחתית בקבוקון הספינר, ואז הרימו את המכסה מזרוע צד אחת של הבקבוקון, והניחו את הפיפטה השואפת פנימה כשהקצה נוגע בקיר הפנימי הנגדי. לאט לאט מסובבים את הפיפטה כלפי מטה, ושואפים לכמחצית מהמדיום.
חידוש עם 20 מיליליטרים של מדיום שלב II טרי על ידי צנרת אותו דרך אותו פתח. השתמשו במלקחיים סטריליים ארוכים כדי להניח בזהירות מוט ערבוב מגנטי אחד בכל באר של צלחת בעלת שש בארות עם גופים עובריים או אורגנואידים של הכליות. הניחו את הצלחת על לוחית ההפעלה המגנטית בעלת ששת הגלגלים, והגדירו את המהירות ל-120 סל"ד.
כדי שפסי ההתעוררות המגנטיים ייצמדו למקומם ויתחילו להסתובב, תחילה הגדירו את רמת ההספק ל-100. ברגע שכל הפסים מתחילים להסתובב, הורידו את רמת ההספק ל-25. לשמור על האורגנואידים של הכליות על ידי שינוי מחצית המדיום כפי שהוכח בעבר.
אימונופלואורסצנציה של מקטעי פרפין של יום 14 אורגנואידים של כליות מראים נוכחות של מקטעי נפרון כגון צינוריות כלייתיות המבטאות גורם גרעיני הפטוציטים-1 בטא ולוטוס טטרגונולובוס לקטין, כמו גם אשכולות פודוציטים המבטאים V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B ונפרין. השינויים בפרוטוקול זה יכולים לתמוך בהתפשטות של תאי האנדותל, כפי שאושר על ידי צביעה עם טסיות דם ומולקולת הידבקות של תאי אנדותל-1 ביום 26 של התרבית. יש לטפל בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים עם Dispase למשך פרק הזמן המתאים, ולאחר מכן לשטוף אותם ביסודיות כדי להסיר את כל העקבות.
אם Dispase אינו מוסר לחלוטין, זה יכול להוביל למוות תאי ואשכולות של גופות עובריות. שיטה זו סייעה לנו לבחון התפתחות של מחלות כליה מולדות, כמו גם מסלולים שונים של פגיעה בכליות ופוטנציאל להתערבויות טיפוליות במבחנה.
