פרוטוקול זה הוא משמעותי כי הוא נועד לענות על שאלות על תפקוד המבנה בקורלציה של שסתום הריאות מורין, וזה בדרך כלל מסובך בגלל ההטרוגניות הטבועה שלה. הקיבעון המבוקר והדמיה המתאם שימשו ללכידת המבנה בקשקשים באורך מרובה. לאחר מכן ניתן למפות תמונות מקומיות ברזולוציה גבוהה בחזרה למיקום האנטומי המדויק על שסתום הריאות.
מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר טאי יי, מנהל מיקרוכירורגיה במרכז לרפואה רגנרטיבית בבית החולים הלאומי לילדים. התחל על ידי עיבוד אוטומטי של הכלים הדרושים לניתוח העכבר, כולל מספריים עדינים, מיקרו-כוחס, מלחציים מיקרו-וסקולריים, מלקחיים להחלת מלקחיים, מחזיקי מיקרונידל, מספריים קפיציים ומפסקים. לאחר המתת חסד עכבר C57BL/6 מבוגר, מניחים אותו בתנוחת התאוששות געש על מגש, מאבטחים את גפיו בקלטת ומבצעים את בית החזה.
לחשוף את הלב על ידי הסרת כל עודף רקמת שומן fascia, ולאחר מכן להסיר את האטריום הימני ולפרוק את החדר השמאלי עם תמיסת מלח בטמפרטורת החדר. הסר את הלב כולו על ידי ניתוק הווריד העליון, וריד קאווה נחות, עורק ריאות, ואבי העורקים, ולחתוך כשני מילימטרים מעל צומת פיתום, אשר ישמש צינור ללחץ. הסר את החדרים השמאליים והימנים כדי לחשוף את התאים ללחץ אטמוספרי, להבטיח כי מבנה תא המטען הריאתי אינו מושפע על ידי הסרת החדרים.
צינורות לחץ Anastomose עם עורק הריאות, משאיר במרחק של כמילימטר בין הצומת sinotubular לבין סוף הצינורות כדי להכיל תנועות גדולות של העלונים ואת גזע הריאות. העלו את המאגר ללחץ פיזיולוגי אנלוגי ומלאו אותו בתמיסת המלח. בדוק את מערכת הזרימה כדי לוודא שאין חסימות או בועות אוויר.
חבר פקק שסתום ריאות anastomosed ולהבטיח זרימה נאותה דרך הצינורות על ידי החלפת דרכי היציאה. ברגע שהזרימה מספיקה, החליפו את הזרימה לשסתום הריאות המנומס והבטיחו לחץ על גזע הריאות שזוהה על ידי התנפחת תא המטען. לאחר אישור לחץ של תא המטען הריאתי, לשלב בהדרגה פתרון קיבוץ ראשוני עד 25% של קיבולת המאגר של תמיסת מלח מטוהר.
מניחים גזה ספוגה הקיבעון על דגימת הרקמה כדי למנוע ייבוש. לנטרל את הקיבעון במשך שלוש שעות, מילוי המאגר כדי לשמור על לחץ מתמיד. לאחר זלוף, לאחסן את שסתום הלב בתמיסה הקיבועית בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש עד שבוע.
להכתמה, לשטוף את דגימת שסתום הלב הקבוע שלוש פעמים עם חיץ קקודילאט טוחנת קר 0.15 במשך חמש דקות לחלוטין להטביע את שסתום הלב בתמיסה של 1.5 אשלגן ferrocyanide, 0.15 קקודילאט טוחנת, שני מילימולרי סידן כלוריד, ו 2% osmium tetroxide על קרח במשך שעה אחת. לשטוף את הדגימות עם טמפרטורת החדר מים מזוקקים כפולים על ידי הצבת אותם בצינור במשך חמש דקות עם עצבנות קלה. לאחר שלוש שטיפות נוספות, מניחים את המדגם בתמיסת thiocarbohydrazide מסוננת בטמפרטורת החדר.
לאחר 20 דקות, לשטוף את המדגם שלוש פעמים עם מים כפי שהוכח קודם לכן. לאחר מכן, מניחים את המדגם ב 2% osmium tetroxide בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, לשטוף אותו עם מים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד ודגורת המדגם ב 1%אורניל אצטט לילה בארבע מעלות צלזיוס.
בינתיים, להכין פתרון של עופרת חנקתית. למחרת, לבצע את שלב הכביסה שלוש פעמים כפי שהוכח קודם לכן, ולאחר מכן לדגור על רקמת שסתום הלב בתמיסת אספרטט עופרת ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לשטוף את הדגימות שלוש פעמים נוספות, ולאחר מכן לבצע טיפול התייבשות סדרתי על רקמות שסתום הלב עם מוכן טרי 20, 50, 70, ו 90%אתנול על קרח במשך חמש דקות כל אחד, ואחריו שני טיפולים הבאים עם 100%אתנול.
לאחר התייבשות, להזיז את הרקמות כדי אצטון קר קרח, ולאחר מכן למקם אותו אצטון טרי בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. עבור הטבעה, להפוך את תערובת שרף על פי מפרטי היצרן. מניחים רקמות בטיפולים הבאים של 25 עד 75, 50 עד 50 ו 75 עד 25 שרף לתערובת אצטון במשך שעתיים כל אחד.
לבסוף, מניחים את הרקמות ב-100% שרף בן לילה. למחרת, מניחים רקמות ב-100% שרף טרי. לאחר שעתיים, מעבירים את הרקמות לקפסולה הטמעה, מוסיפים שרף טרי 100% ומניחים אותו בתנור 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לריפוי.
עורק הריאות המופק לפני ואחרי היישום של לחץ הידרוסטטי מוצג כאן. תא המטען הריאתי נפוח באופן רדיאלי ומציין כי עלוני שסתום הריאות נמצאים בתצורה סגורה. טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת אישרה את אישור שסתום הריאות.
העלונים היו סגורים והאנולוס היה מעגלי בעוד דרגות שונות של לחץ שסתום ריאתי לקוי על ידי קיבוע או קריסת עורקים נצפו. עוצמת הקול של מיקרו CT בעיבוד חתך רוחב וירטואלי הייתה מתואמת עם תמונות אופטיות כדי לאשר את כיוון החתך והמיקום. תמונות SBF SEM ברזולוציה גבוהה צולמו באזור מקומי בתוך עלון כאשר בלוק הדגימה היה במיקום הרצוי ובכיוון.
תמונות מתואמות בין עוצמת הקול של מיקרו CT שמעבדות פרוסה וירטואלית, רזולוציה נמוכה ותמונות SBF SEM ברזולוציה גבוהה מוצגות כאן. בייצוג תלת-ממדי של אזור מקוטע של שסתום הריאות, ניתן לזהות רכיבים חוץ תאיים כמו תאי אנדותל, תאים ביניים valvular וסיבים חוץ תאיים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור כי ביצוע לחצים הוא קריטי ויבטיח את התשואה להיות גבוהה ככל האפשר.
