פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור החוקרים שרוצים לפתח שיטות לייצור AAV וטיהור באמצעות מערכת תרבית תאים baculovirus-חרק. ייצור AAV באמצעות מערכת תרבית תאים baculovirus-חרקים היא שיטה חסכונית כי הוא קל להגדיל והוא תואם את תרגול הייצור הטוב הנוכחי. חלקים מסוימים של הפרוטוקול יודגמו על ידי אלן הייזר, עוזר מחקר של המעבדה שלי.
התחל על ידי הפשרת מקטורינה אחת של תאי Sf9, ומיד לזרוע אותם ב 15 מיליליטר של מדיום תרבית תאי חרקים. לגדל תאי Sf9 באינקובטור שייקר מסלולית ב 125 סל"ד ו 28 מעלות צלזיוס בבקבוקונים עגולים עם כובע מחובר באופן רופף לחילופי אוויר. להפיץ את התאים בבקבוקון ליטר אחד המכיל 200 מיליליטר של בינוני כדי להשיג מספיק תאים לייצור תאי TIPS.
הוסף 50 מיליליטר של תאי Sf9 ב 2 כפול 10 לתאי כוח 6 למיליליטר בשני צלוחיות. להדביק בקבוקון אחד של תאי Sf9 עם 0.5 מיליליטר של baculovirus-AAV2-GFP, ואת הבקבוקון השני של תאים עם 0.5 מיליליטר של baculovirus-AAV2-rep-cap. שלושה ימים לאחר מכן, לקצור aliquot קטן של תאי Sf9 נגועים baculovirus, הידוע גם בשם תאי TIPS.
כתם 2 כפול 10 בחזקת ה-5 של תאי Sf9 לא נגועים ונגועים בבקולווירוס עם 0.5 מיקרוגרם של נוגדן נגד בקולווירוס gp64 של עכבר המכיל צבע פלואורסצנטי ב-100 מיקרוליטרים של חסימת חוצץ למשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה בחושך. לאחר שטיפת התאים עם PBS כדי להסיר את הנוגדן, להשעות מחדש את התאים המוכתמים ב 300 microliters של PBS המכיל 0.5 אלבומין סרום בקר. לנתח את הביטוי baculovirus gp64 על תאים באמצעות cytometry זרימה.
כאשר התאים הם 80 עד 90%קיימא, עם עלייה בקוטר, לקצור את התאים cryopreserve 1 פעמים 10 כדי 7 תאי כוח מיליליטר של מדיום תרבית חרקים, מוחלף עם 10% סרום שור עוברי ו 10% דימתיל סולפוקסיד במיכל הקפאה איטית ב 80 מעלות צלזיוס שליליות. למחרת, להעביר את הצינור המכיל תאי TIPS למקפיא חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. תרבות ולגדל תאי Sf9 נאיביים ב 2 כפול 10 עד 6 תא כוח למיליליטר ב 28 מעלות צלזיוס בכמה צלוחיות שני ליטר המכיל 400 מיליליטר של מדיום תרבית תאי חרקים בחממה שייקר הדרושה לווירוס הקשור לאדנו או לייצור AAV.
לאחר שלושה עד ארבעה ימים, צפיפות התאים גדלה עד 5 עד 6 כפול 10 עד 6 תאי כוח למיליליטר. לייצור AAV בבקבוקונים באינקובטור שייקר מסלולית, השתמש בפיפטה או במשאבה פרייסטלית כדי לזרוע 400 מיליליטר של תרבית Sf9 ב 2 כפול 10 עד 6 תאי כוח למיליליטר לתוך בקבוקון שני ליטר, באופן אספטי. הגדירו את שייקר המסלול ב-125 סל"ד ו-28 מעלות צלזיוס.
הפשירו מעין אחד של כל תאי טיפה של באקולווירוס-AAV-GFP ובאקולווירוס-AAV-rep-cap TIPS. לדלל את התאים עם 20 מיליליטר של מדיום תרבית חרקים, ולבצע ספירת הכדאיות של התאים באמצעות כחול טריפן. לחסן את שני תאי TIPS ביחס של 1 עד 10, 000 ביחס לתאי Sf9 נאיביים בתרבית בקבוקון שייקר או ביו-כור.
ביום השני, לקצור מיליליטר אחד של תרבות Sf9 aseptically, וכתם עם צבע כחול טריפן כדי לנתח את ספירת התאים, הכדאיות, ומורפולוגיה. ביום השלישי, חזור על השלבים שבוצעו ביום השני, ובדוק את מצב זיהום baculovirus לאחר הכתמת תאי Sf9. ביום החמישי, חזור על השלבים שבוצעו ביום השני, ולאחר מכן לקצור את המדיום התרבותי ואת התאים כאשר הכדאיות Sf9 ירדה לסביבות 50%לאסוף את supernatant ואת גלולה התא לאחר ספינינג, ולאחסן אותם ב מינוס 80 מעלות צלזיוס.
לאחר הפשרת גלולה תא AAV-היצרן, להוסיף חוצץ תמוגה תא לתערובת במרץ. לדגור את הכדור מושעה מחדש במשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה כדי לשחרר את חלקיקי AAV. לאחר צנטריפוגה, להעביר את התא lysate למיכל חדש.
מערבבים את lysate התא ואת תרבית התא supernatant לאחר הפשרה. הוסף 20 יחידות למיליליטר נוקלאז ומגנזיום כלוריד 10 מילימולרי לתא ליסאט כדי לעכל את ה- DNA וה- RNA, ודגור במשך שעתיים עד ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס. סנן את הליזאט באמצעות מיקרומטר 0.8 ומערכת סינון כפול של פוליאתרסולפון 0.2 מיקרו באמצעות משאבה.
יש לאחסן את התא המובהק ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, או לטהר את ה-AAV באופן מיידי. הר עמוד AVB ספרוז 10 מיליליטר על מכונת הכרומטוגרפיה, והכנס את הצינור לתוך דגימת AAV, חוצץ לשטוף, חוצף elution. הכנס צינורות לחריצי אספן השברים של מכונת הכרומטוגרפיה כדי לאסוף את שברי הפתרון העובר בעמודה, מאגר הכביסה ומאגר ההבחנה המכיל את חלקיקי AAV.
שיד את העמודה AVB Sepharose עם חמישה כרכים בעמודה של PBS בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה. טען את ליסאט התא המסונן המכיל חלקיקי AAV על עמוד הזיקה AVB Sepharose באמצעות מכונת הכרומטוגרפיה המצוידת במשאבת דגימה. הפעל את המדגם בקצב זרימה של שלושה מיליליטר לדקה.
הפעל PBS דרך העמודה בקצב זרימה של שלושה מיליליטר לדקה עד עקומת הספיגה האולטרה סגולה ב 280 ננומטר חוזר לקו הבסיס והופך יציב. יש לבחון את חלקיקי AAV מעמודת AVB Sepharose עם נתרן סיטראט 50 מילימולרים חוצץ pH 3 בקצב זרימה של שלושה מיליליטר לדקה. מיד לדלל את supernatant AAV עם נפח חמישית של 500 מילימולר Tris HCl pH 8.0 כדי לנטרל את מאגר האליטה החומצי המכיל AAV.
פעולה זו מונעת השפלה בתיווך pH שעלולה להתרחש עם מאגר חומצי pH 3.0 elution. לאחר מכן לדלל את AAV supernatant פי עשרה עם PBS, כך חלקיקי AAV נמצאים במאגר פיזיולוגי. יש לאחסן מיליליטר אחד של כל דגימות ריצה, חוצץ כביסה ו-100 מיקרוליטרים של ה-AAV הנלהב כדי להעריך את נוכחותו של AAV על ידי זיהום של תאי היעד.
הגדר את מערכת סינון הזרימה המשיק, מצויד מחסנית קרום polyethersulfone עם 100 קילודלטון משקל מולקולרי ניתוק כדי לרכז את AAV. הפעל 200 מיליליטר של PBS במשך 10 דקות כדי לשרטט את מודול סינון זרימה משיק. טען את דגימת AAV על ידי שליטה בזרימת המשאבה עד שהדגימה מצטמצמת לנפח הרצוי.
דילפלט את ההטנטציה מחדש עם 100 מיליליטר של PBS. לאחר ריכוז דגימת AAV לנפח הרצוי, אסוף את דגימת AAV, סנן אותו דרך מסנן פוליאתרסולפון 0.2 מיקרומטר, ועליקט אותו. לאחר מכן לאחסן את מדגם AAV ב מינוס 80 מעלות צלזיוס.
רוב תאי Sf9 נדבקו בנגיף הבאקולו בשלושה עד ארבעה ימים, בשל סבבי ההדבקה המרובים, עדות לביטוי gp64 baculovirus gp64. רוב התאים גם מראים עלייה בקוטר. התאים מראים עלייה בקוטר, אפקט ציטוטופתי, וכמחצית מהתאים מתים בחמישה ימים לאחר ההדבקה, שהם הסימנים להשלמת הייצור של AAV.
שיא של חלבון נראה תוך כדי אלוטציה עם חוצץ חומצי המתאים לשבר AAV. דגימות ה-AAV המטוהרות מציגות שלושה חלבוני קבסיד נפרדים: VP1, VP2 ו-VP3, לאחר כתמי SDS-PAGE וכסף. הצעד הקריטי ביותר הוא קצירת תאי TIPS לפני cryopreservation, כאשר רוב התאים להיות נגועים baculovirus, עם מספר מינימלי של מוות תאים.
תיארנו את הייצור והטיהור של וקטור AAV של סרוטיפ 2 כמודל כאן. עם זאת, ניתן להחיל את הפרוטוקול גם על סרוטיפים אחרים של AAV.
