The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

<html> 1. גידול Ae. מבוגרים aegypti <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים בוקעים בכ ¾ אינץ &#39;מים במגש רדוד. צפיפות תקטין את הגודל של מבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלים אחוריים במהירות של 25 ° C (12-HL: 12-HD) ולהאכיל עם מזון לדגי קרקע. הערה: האכלת יתר עלולה להפחית את שיעורי הישרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר גלמים בנפרד על ידי פיפטה פסטר היומית ולהעביר לצלחות פלסטיק (9 סנטימטרים × 5.5 סנטימטרים) בתוך דליי בלימה קטנים עם מכסי רשת בסדר, וכך יוצר 24 קבוצות גיל hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% תמיסת סוכרוז יתושים בוגרים Feed על ידי כדור צמר גפן שהונחה על קירות המסך של דיור כלוב היתושים בתא סביבתי על 27 מעלות צלזיוס ו -70% לחות יחסית באותם photoperiod כזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאלקטרופיזיולוגיה, להשתמש 5-10 ישנים בעלי חיים יום. באופן כללי, בעלי חיים גדולים יותר יפיקו תוצאות טובות יותר. לבידוד RNA, להשתמש בבעלי חיים הנמצאים בקיבוץ גיל 24 שעות בודדות בטווח הישן 5-10 היום. </li></ol>התחת = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. הכנת כימיקלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ריכוז מתאים של אלקטרוליטים (למשל 1-10 מ&quot;מ) שמעורר פעילות מינימאלית מתאי עצב תחושתיים שנבחרו. 10 מ&quot;מ NaCl או 1 המ&quot;מ KCl הם אלקטרוליטים סבירים כדי לבדוק את הפעילות בסיסית כאשר מתחיל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים כל כימי ניסיוני בממס מתאים (אם לא מים, להשתמש באתנול או DMSO) שיש לו השפעה מועטת, אם בכלל, על פעילות ספייק בהשוואה לאלקטרוליט לבד. ריכוזים סופיים של 10% אתנול או DMSO 1% ריכוזים התחלה סבירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מתאים (למשל כינין למר או סוכרוז למתוק) כימיקלים שליטה המתוארות היטב הרתעה האכלה או ממריצים בחרקים. </li></ol> 3. אלקטרופיזיולוגיה (הקלטת טיפ 8; איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות זכוכית טופס מכאני מושך נימי זכוכית. לייעל חום ולמשוך הגדרות למשוך זכוכית כדי ליצור recordi בצורה הולמתאלקטרודות ng. לשבור בזהירות את סוף אלקטרודת זכוכית באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח כדי ליצור קצה האלקטרודה פתיחה שהוא רחב מספיק כדי לעטוף Sensillum היעד, אך קטן מספיק כדי להימנע ממגע עם מבנים שכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ, מבחינה ויזואלית לזהות על ידי מורפולוגיה ומקם את sensilla / Sensillum היעד כדי להבטיח את דירות של הקלטת קצה. בעלי החיים Prep כדי לאפשר גישה חופשית לsensilla מזווית כניסת האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרקים קרים מבוגרים להרדים במקפיא ב -20 ° C. למנוע נזק לתאי עצב היקפי על ידי חשיפה לטמפרטורות קרות. חותך רצועות צרות של קלטת צלופן עם סכין גילוח על שקופיות זכוכית. לשתק חרקים שלמים בשקופית זכוכית באמצעות רצועות צרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס תיל טונגסטן חידד כימי לתוך בית חזה הגב או עין לשמש את האלקטרודה אדישה (קרקע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא אלקטרודת זכוכית נעשתה בשלב 3.1 עם פתרון מגרה של עניין. באמצעות מזרק הוכנס, למלא כובעillary מקצה משך להקהות סוף. גרור את כל בועות האוויר, מחזיק סוף הוריד. הכנס חוט כסף (chloriding אופציונאלי) לאלקטרודת הזכוכית נעשתה בשלב 3.1 לשמש הקלטה והאלקטרודה מגרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אלקטרודות למגבר קדם שנועד להקלטות מsensilla chemoreceptive קשר בחרקים. מגבר קדם זה (300 הרץ-3 מסנן bandpass kHz) יפחית את הזמן להתיישב כדי ללכוד פעילות עצבית קרובה לגירוי הקדמה ככל האפשר. לאסוף, לאחסן ולנתח אותות חשמליים באמצעות מייקרו-מחשב מצויד בתוכנת הקלטת ספייק. הערה: הארקת הגדרת ההקלטה כראוי עשויים לשפר בצורה דרסטית יחס אות לרעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר sensilla עם פתרון שליטה (אלקטרוליט בלבד) כדי להבטיח פונקציונליות. רוזן קוצים מתחילים 200 אלפיות שניים הבאים חפץ הגירוי לכל ההכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופן אקראי את סדר הכימיקלים מבחן עבור כל הניסויים, למעט מחקרי מנה-תגובה,לחסל את ההטיה. ללימודי מנה-תגובה, לחשוף sensilla להגדלת ריכוזים של חומר כימי ניסיוני. לאפשר מינימום של 3 דקות בין גירויים כדי להבטיח התאוששות נאותה. הערה: דרישה זו עשויה להשתנות בהתאם לחרקים וsensilla. סף מוגדר כריכוז שבי שגיאה סטנדרטית אינה חופפת עם שגיאת התקן לריכוז הנמוך ביותר שנבדק. </li></ol> 4. בידוד RNA ורצף (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עלי RNase ללא הדוק שלבש על ידי קירור אותם על קרח יבש לפני עלי RNase ללא ליווי הרקמה disruption.Prepare שמתאימים צינורות כובע הצמד בחוזקה. שמור צינורות איסוף סגורים, אלא אם כן באופן פעיל לנתח כדי למנוע התעבות עודפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות aspirator המסונן, מקום 30 עד 40 יתושים-הרדים קרים (15 שניות ב-20 ° C במקפיא) על במה קרה ולמיין לפי מין. בעלי חיים מקום מגבים בצד למטה, לתפוס כנפיים לא לפגוע נספחים טעם.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בשני זוגות מלקחיים עדינים, לנתח labella זיווג או טרסי מזכרים או נקבות תחת מיקרוסקופ לנתח ולהגביל את ההכללה של רקמות סמוכות. הערה: 500 labella לזווג תשואה של כ 800-1,000 ננוגרם של mRNA הכולל. 400 טרסי הבודד (5 מגזרים כל אחד) להניב 1,200-1,800 ננוגרם של mRNA הכולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של התנשמות-מלקחיים, קל לתפוס חוטם יתושים רק הפרוקסימלי לlabella חושף stylets הפנימי. באמצעות זוג אוסף-מלקחיים אחרים, להסיר labella ולהוסיף רקמה לצד שני של צינור איסוף קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של מלקחיים, קל לתפוס רגל יתוש בצומת של עצם השוק ומגזר tarsal הראשון. באמצעות זוג מלקחיים אחר, להסיר טרסי ולהוסיף רקמה לצד שני של צינור איסוף קר. הערה: קח בחשבון את סוגי התאים בממשק של רקמה רצתה ולא רצוי. אמנם חשוב להגביל את הכללת השכנה רקמה, זה חשוב לא פחות לא להשמיט חלקים מרקמה רצויה. Fiמדגם סופי חייב לייצג במדויק את כל האיבר של עניין. צור גבול מדויק עם המלקחיים האחיזה כך שמלקחי אוסף דווקא יכולים לשחרר על ידי גירוד או תופסים רק את הרקמה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעת לעת, ספין למטה צינור איסוף בקצרה בצנטריפוגה C ° 0 ב9,000 XG לשמור רקמות בחלק תחתון של צינור. אם לחות מצטברת בצינורות איסוף במהלך נתיחה, להוסיף 50uL של מגיב Trizol הקר לכיסוי רקמה שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סמן מעבדה אנטי כתם, באופן ברור לתייג מיליליטר RNase ללא אחד 1.5 להצמיד צינור כובע לכל סוג רקמה לאוסף. שימוש במתלת צינור 1.5 מיליליטר וחנקן נוזלי, להקפיא אז לטחון רקמות לאבקה דקה (חתיכות בסדר אם בTrizol). חזור פעם אחת. תביא נפח כולל של Trizol 1 מיליליטר ו resuspend רקמת קרקע על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 ul של כלורופורם ומערבבים היטב. אחרי 5 דקות בטמפרטורת חדר, ספין למטה בצנטריפוגות ב 4 ° C ו11,000 XG במשך 15 דקות. זהירותלהוסיף שכבה מימית ישירות לעמודת מסנן הדנ&quot;א הגנומי. ספין למטה ב11,000 x ז במשך 5 דקות. הוספת נפח שווה של אתנול 70% RNase ללא לזרום דרך ומערבבים על ידי pipet. העבר את הנוזל לעמודת אוסף RNA ולהמשיך הפקת RNA להוראות שסופקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת ולהעריך את טוהר של RNA הכולל על ספקטרופוטומטר דיוק ולהמשיך בכל שיטת רצף RNA סטנדרטית. </li></ol> 5. כמותי RT-PCR אישור של RNA רצף (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר גנים רבים ככל האפשר כדי להשוות רמות ביטוי גנים יחסי על פני טווח דינמי, הן בשפע רצף חזה ותפקוד גן chemosensory חזקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוגות פריימר עיצוב עבור כל גן המטרה להגביר מוצר PCR 100-180 basepair ספציפי. תכלול ההגברה gDNA שאינו ספציפית על ידי הבטחת פריימר אחד לפחות לכל סט משתרע על פני גבול אינטרון. לחלופין, להשתמש בטיפול DNase כדי להפחית זיהום גנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוףרקמת חרקים כפי שתואר בסעיף קודם. לחשב כמה רקמות נדרש לספק מספיק RNA להשלים את כל תגובות qRT-PCR. הערה: בשלושה עותקים ביולוגיים ותגובות שלושה עותקים טכניים יספק ביטחון מרבי בתוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב כימות גן יחסי כיעד X - (CT [היעד] -Ct [התייחסות]) עבור כל גן המטרה וממוצע לכל לשכפל, ביולוגי וטכני. השתמש בגן ​​משק (ים) לנרמל ערכי ה- CT בין משכפל ביולוגי ולעקור את היקף ציר Y בהשוואות של ביטוי יחסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הדמיון של RNA-seq ומערכי נתוני qRT-PCR באמצעות מבוסס רגרסיה, הליך bootstrap שקילות 9, איטרטיבי מיושם, לנתונים מכל רקמה. הערה: הליך זה מזהה את &quot;האזור של דמיון&quot; הקטן ביותר שניתן לבנות סביב נתוני RNA-seq וqRT-PCR שנצפו, ולאפשר ביטוי גנים היחסי כפי שהיא נמדדת על ידי qRT-PCR כדי להיחשב מבחינה סטטיסטית שווה ערך למדידה של ביטוי גנים יחסי על ידי RNA-seq. </li></ol>

<ol>
	<li>Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellent+and+deterrent+effects+of+SS220,+picaridin,+and+DEET+suppress+human+blood+feeding+by+Aedes+aegypti,+Anopheles+stephensi,+and+Phlebotomus+papatasi.">Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi.</a> J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).</li><li>Dickens, J. C., Bohbot, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+Mode+of+action+of+mosquito+repellents.Pestic.">Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic.</a> Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).</li><li>Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+chemosensory+appendages+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae+reveals+tissue-+and+sex-specific+signatures+of+odor+coding.">Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding.</a> BMC Genomics. 12 (271), (2011).</li><li>Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+transcriptomic+analysis+of+chemosensory+receptors+in+a+pair+of+divergent+ant+species+reveals+sex-specific+signatures+of+odor+coding.">Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding.</a> PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).</li><li>Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+adult+Drosophila+antenna+by+high-throughput+sequencing.">Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing.</a> Zoological Studies. 52 (42), (2013).</li><li>Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., R&#252;tzler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+Aedes+aegypti+odorant+receptor+gene+family.">Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family.</a> Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).</li><li>Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odour+receptors+and+neurons+for+DEET+and+new+insect+repellents.">Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents.</a> Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).</li><li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+a+primary+chemoreceptor+unit.">The physiology of a primary chemoreceptor unit.</a> Science. 122 (3166), 417-418 (1955).</li><li>Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regression-based+equivalence+test+for+model+validation:+shifting+the+burden+of+proof.">A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof.</a> Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq.</a> Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li><li>Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+receptor+neuron+responds+to+DEET+and+other+insect+repellents+in+the+yellow-fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).</li><li>Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+receptor+expression+in+the+labella+and+tarsi+of+Aedes+aegypti.">Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).</li><li>Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gr+family+of+candidate+gustatory+and+olfactory+receptors+in+the+yellow-fever+mosquito+Aedes+aegypti.">The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti.</a> Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).</li><li>Ramsk&#246;ld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundance+of+ubiquitously+expressed+genes+revealed+by+tissue+transcriptome+sequence+data.">An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data.</a> PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+based+criterion+for+gene+expression+calls+using+RNA-seq+data.">A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data.</a> Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).</li><li>Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+active+genes+in+deep+RNA-seq+gene+expression+studies.">Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies.</a> BMC Genomics. 14 (778), (2013).</li><li>Isono, K., Morita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+designs+of+insect+taste+receptor+system.">Molecular and cellular designs of insect taste receptor system.</a> Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ההיבט המאתגר ביותר של פוטנציאל פעולת הקלטה מsensilla התעורר אצל הוא להחליט איזה תגובות הם &quot;נורמלים&quot;. כאשר העסקת קצה Sensillum התעורר אצל אחת הקלטה בפעם הראשונה לניתנו מיני חרקים, מספר הכולל ורגישויות של תאי עצב קולט התעורר אצל (GRNs) הם סביר להניח לא ידוע. הקלטות ראשוניות ר?...

תרכובות כמו DEET, Picaridin, Citronellal וIR3535 הוכחו ביעילות להדוף יתושים, כולל Aedes וקטור מחלה החשוב aegypti 1,2. אנו רושמים פוטנציאל פעולה מתא עצב תחושתי הקשורים sensilla התעורר אצל ספציפי כדי לקבוע את התאים מעורבים עם דחיית יתושים. בשילוב עם רצף במורד הזרם של גנים המתבטאים ברקמות אלה, אנו עשויים לזהות את הגנים סביר להניח תיווך התגובות של תאים אלה כדי להקרין תרכובות חדשות ליכולות דחייה השתפרו. RNA-seq הוא כלי רב עוצמה, הופך סטנדרטי למעקב אחר שינויים של זמן ומרחב בביטוי גנים במהירות. RNA-seq ניתוחים של איברים chemosensory חרקים ואיברים שימשו לחשוף קולטנים מולקולריים בכמה מיני חרקים 3-5, שיפור משמעותי בגן מבוסס PCR קונבנציונלי חיפושים על ידי גן 6. חרקים מייצגים את מעמד בעלי החיים המגוון ביותר, מראשsenting הזדמנויות רבות ללמוד את הקשר בין גנים ופנוטיפים ייחודיים. טכנולוגית RNA-seq יכולה להיות מועסק על כל רקמת חרקים חיים. כמו כן, הקלטת אלקטרו מתאי חישה בתוך sensilla התעורר אצל uniporous ניתן להשיג במינים חרקים רבים ושונים. הזיווג של שתי הטכניקות הללו מאפשר לחוקרים כדי לצמצם גני הסט מעורבים בפנוטיפ chemosensory נצפה. מינים שונים יציגו אתגרים ספציפיים, אך עשוי להודיע ​​על הקשר בין גני קולט chemosensory והסתגלות chemosensory. הגודל והמורפולוגיה של sensilla chemosensory משתנה ועשוי לדרוש פתרון בעיות נרחבות בעת הקלטת פוטנציאל פעולה כדי להפחית את הרעש ולזהות אותות הדיר. ניתוחים של איברי chemosensory עשויים להיות טריוויאלי או עדין וזמן רב, בהתאם למורפולוגיה וגודל של החרק. שחזור של RNA באיכות גבוהה עשוי לדרוש כמה פתרון בעיות, כמו גם, כגון הימנעות פיגמנטים מסוימים במהלךאוסף רקמות. תוך שהם מפגינים את ההשפעות של תרכובות דוחה באמצעות ניסויים התנהגותיים הוא ישיר ואינפורמטיבי, גישה זו היא זמן אינטנסיבי ורחב ביחס למנגנון פעולה. אלקטרופיזיולוגיה בשילוב עם RNA-seq מאפשרת לניתוחים ספציפיים יותר של מה שמניע את התנהגויות הימנעות בחרקים. ברגע ש&quot; ארגז הכלים &quot;של אפליה כימית זוהה במיני חרקים, ניסיונות ספציפיים יותר על מנת לשפר את דוחי ידועים הם אפשריים. קולטנים וחלבונים הקשורים בתאי חישה אחראים להתנהגויות אלה עשויים לבוא לידי ביטוי heterologously להקרנה כימית ישירה. יתר על כן, הדמיה מולקולרית יכולה לנבא איזה כימיקלים יהיו לעורר תגובה חזקה מקולטנים אלה 7. תמונת המצב של כל הגנים הפעילים בקבוצה צרה של רקמות chemosensory יכול להיות גם שימושית בזיהוי גנים דומים במינים אחרים. באמצעות הומולוגיה ברצף וsi הביטויmilarities, חוקרים עלולים להיווצר סטים של קולטנים מולקולריים סביר להניח תיווך תגובות לדוחים שהם רחב אפקטיביים על חרקים. אנו מציגים את הפרוטוקול הבא כדי לעזור לחוקרים בפירוק מסלולי chemosensory חרקים ולשכנע יותר להתעמק neuroethology של אי-מודל וחרקים חשובים מבחינה כלכלית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1272">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:367px;">Company</td>
			<td style="width:189px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:467px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:367px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:189px;">628000</td>
			<td>Standard, 1.5mm X 0.86mm, 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Silver wire</td>
			<td style="width:367px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:189px;">7875</td>
			<td>.015&#34; bare</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tungsten wire</td>
			<td style="width:367px;">Alfa Products</td>
			<td style="width:189px;">369</td>
			<td>0.127mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:367px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:189px;">11252</td>
			<td>#5SF Inox</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Refridgerated stage</td>
			<td style="width:367px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:189px;">1429</td>
			<td>Chill Table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Preamplifier</td>
			<td style="width:367px;">Syntech</td>
			<td style="width:189px;">Taste Probe</td>
			<td style="width:467px;">preamplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Software for electrophysiology</td>
			<td style="width:367px;">Syntech</td>
			<td style="width:189px;">Autospike</td>
			<td style="width:467px;">software for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">TetraMin fish food</td>
			<td style="width:367px;">Tetra</td>
			<td style="width:189px;">Tropical fish food granules</td>
			<td>fish food ground to fine powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596-026</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:189px;">74136</td>
			<td style="width:467px;">includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Nano Drop Products</td>
			<td style="width:189px;">ND-1000</td>
			<td>tabletop spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:251px;">R statistics</td>
			<td style="width:367px;">freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)</td>
			<td>www.r-project.org</td>
			<td>Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1.5ml tube rack</td>
			<td style="width:367px;">Evergreen</td>
			<td style="width:189px;">240-6388-030</td>
			<td>Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1.5mL collection tubes with pestle</td>
			<td style="width:367px;">Grainger</td>
			<td style="width:189px;">6HAX6</td>
			<td>RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11178160</td>
			<td>Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 mL tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primer-BLAST Primer Designing tool</td>
			<td style="width:367px;">NCBI</td>
			<td style="width:189px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

הקלטות שמץ של פוטנציאל פעולה מAe. sensilla התעורר אצל aegypti (איור 1) להדגים את היעילות של גירוי ישיר עם מגוון רחב של כימיקלים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לכמת את תגובות לכל גירוי כימי על ידי ספירת קוצים של משרעת ומשך נתון על פני טווח זמן סביר (בדרך כלל פחות מ -500...

Watch this Scientific Journal Video about Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti at JoVE.com

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

באמצעות שתי שיטות להערכת ביטוי גנים בנספחים התעוררו אצל הגדולים של Aedes aegypti, זיהינו הקבוצה של גני putatively בסיס התגובות עצביות לתרכובות מרות ודוחות, כפי שנקבע על ידי בדיקת אלקטרו.

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

physiological-recordings-rna-sequencing-gustatory-appendages-yellow

Research

JoVE Journal

Biology

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

8.0K Views.  United States Department of Agriculture.  באמצעות שתי שיטות להערכת ביטוי גנים בנספחים התעוררו אצל הגדולים של Aedes aegypti, זיהינו הקבוצה של גני putatively בסיס התגובות עצביות לתרכובות מרות ודוחות, כפי שנקבע על ידי בדיקת אלקטרו. 

Video: Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

בניית יתוש עדיף: זיהוי הגנים הפעלת מלריה קדחת דנגי ההתנגדות ב א gambiae וא aegypti יתושים

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,<em&gt; אדס המפוספס</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

שמירה על Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the foundation to develop novel strategies for pest control. Here, a series of methods are described that are routinely utilized to determine the functional roles of neuropeptides and other neuronal factors (i.e., biogenic amines) on the excretory system of the mosquito, Aedes aegypti. The Malpighian tubules (MTs), responsible for primary urine formation, can continue functioning for hours when removed from the mosquito, allowing for fluid secretion measurements following hormone treatments. As such, the Ramsay assay is a useful technique to measure secretion rates from isolated MTs. Ion-selective microelectrodes (ISME) can sequentially be used to measure ion concentrations (i.e., Na+ and K+) in the secreted fluid. This assay allows for the measurement of several MTs at a given time, determining the effects of various hormones and drugs. The Scanning Ion-selective Electrode Technique uses ISME to measure voltage representative of ionic activity in the unstirred layer adjacent to the surface of ion transporting organs to determine transepithelial transport of ions in near real time. This method can be used to understand the role of hormones and other regulators on ion absorption or secretion across epithelia. Hindgut contraction assays are also a useful tool to characterize myoactive neuropeptides, that may enhance or reduce the ability of this organ to remove excess fluid and waste. Collectively, these methods provide insight into how the excretory system is regulated in adult mosquitoes. This is important because functional coordination of the excretory organs is crucial in overcoming challenges such as desiccation stress after eclosion and before finding a suitable vertebrate host to obtain a bloodmeal.

This protocol outlines methodologies behind the Ramsay assay, ion-selective microelectrodes, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) and in vitro contraction assays, applied to study the adult mosquito excretory system, comprised of the Malpighian tubules and hindgut, to collectively measure ion and fluid secretion rates, contractile activity, and transepithelial ion transport.

חקר הפעילות של נוירופפטידים ורגולטורים אחרים של מערכת ההפרשה יתוש למבוגרים

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when acquiring a blood-meal. To locate a host to feed on, mosquitoes rely on a wide range of sensory cues, including visual, mechanical, thermal, and olfactory. The study details a technique, electroantennography (EAG), that allows researchers to assess whether the mosquitoes can detect individual chemicals and blends of chemicals in a concentration-dependent manner. When coupled with gas-chromatography (GC-EAG), this technique allows to expose the antennae to a full headspace/complex mixture and determines which chemicals present in the sample of interest, the mosquito can detect. This is applicable to host body odors as well as plant floral bouquets or other ecologically relevant odors (e.g., oviposition sites odorants). Here, we described a protocol that permits long durations of preparation responsiveness time and is applicable to both female and male mosquitoes from multiple genera, including Aedes, Culex, Anopheles, and Toxorhynchites mosquitoes. As olfaction plays a major part in mosquito-host interactions and mosquito biology in general, EAGs and GC-EAG can reveal compounds of interest for the development of new disease vector control strategies (e.g., baits). Complemented with behavioral assays, the valence (e.g., attractant, repellent) of each chemical can be determined.

The present article details a step-by-step protocol for successful and low noise electroantennograms in several genera of mosquitoes, including both females and males.

מדריך שלב אחר שלב לאלקטרואנטנוגרפיה של יתושים

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...