פרוטוקול זה מספק שיטת in vivo חלופית לחקר תפקיד גדילת הגידול של נוקאאוט גן קטלני עוברי. היתרון של שיטה זו הוא שניתן לבצע נוקאאוטים של גנים שהם בדרך כלל קטלניים עובריים בגידולים שמקורם במודל עכבר מהונדס גנטית כדי לחקור את אובדן ההשפעות התפקודיות שלהם in vivo. ניתן ליישם טכניקה זו על מחלות הדורשות לחקור את תפקידם של גנים חיוניים עובריים שאינם ניתנים להשגה ממודלים מסורתיים של עכברי נוקאאוט גנים.
יצירת המודל של בעלי החיים לוקחת זמן ונדרשות בדיקות אמפיריות כדי לקבוע את ה- MOI האופטימלי לזיהום אדנו-ויראלי כדי להבטיח כי רקומבינציה מתאימה מושגת. ראשית, זהה את העכבר עם הגנוטיפ הרצוי. כאשר עכבר נושא גידול מגיע לנקודת הקצה ההומאנית שלו, הרדים את העכבר והשתמשו בסכין אזמל סטרילית כדי להסיר את הגידול.
נתחו את הגידול לשלושה חלקים בחיתוכים בסגנון כיכר לחם באמצעות סכין אזמל כדי ליצור את מקטעי הרקמה לפרפין קיבוע פורמלין המטביע יצירת תרביות מעבר מוקדמות והקפאת הבזק לניתוחים אנליטיים. הכתימו חתך רקמה עבה של חמישה מיקרומטרים עם המטוקסילין ואאוזין עם המטוקסילין ואאוזין. ברגע שפתולוג מאשר את הגידול, בצע את הכתם האימונוהיסטוכימי כדי לאשר את אבחנת הגידול.
מניחים את רקמת הגידול של נדן העצב ההיקפי הממאיר שנאספה זה עתה ב-10 מיליליטרים של PBS סטרילי קר כקרח על קרח, ולאחר מכן מעבירים אותה לאזור עבודה סטרילי כדי ליצור תרביות מעבר מוקדמות. מצמצמים את רקמת הגידול לחתיכות של שניים עד ארבעה מילימטרים ומקציפים שמונה עד 10 פעמים בצלחת תרבית רקמה מטופלת של 10 סנטימטרים רבועים המכילה 10 מיליליטרים של מדיום גדילה. תרבית רקמות אלה במדיום גדילה DMEM-10 עתיר גלוקוז בתוספת 10 ננומולר נוירגולין-1 בטא ושני פורסקולין מיקרומולריים.
זרעו את תאי הגידול המוקדמים שעברו בצפיפות של פי 1.5 10 עד התאים השישיים לכל צלחת תרבית רקמה שטופלה ב-10 מ"ר המכילה מדיום גדילה DMEM-10. לאחר 12 עד 16 שעות, שטפו את התרביות הדבקות בשניים עד ארבעה מיליליטרים של DPBS, והדביקו את התאים באדנו-וירוס בכ-400 יחידות יוצרות פלאק לכל תא ב-10 מיליליטרים של DMEM ללא סרום. לאחר 48 שעות של זיהום, בדקו לזמן קצר את התאים לאיתור אות EGFP במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח זיהום יעיל עם כ-50 עד 100% תאים חיוביים, ולאחר מכן FACS ממיינים את התאים הנגועים החיוביים ל-EGFP.
לאחר מיון FACS, תנו לתאים להתאושש באינקובטור תרבית רקמה למשך 24 עד 48 שעות לפחות, ולאחר מכן הכינו את התאים לניתוחים מבוססי תאים במבחנה או להשתלת in vivo. אשרו את מחיקת Erbb4 על ידי ביצוע PCR באמצעות דנ"א גנומי שבודד מחלק מהתאים החיוביים ל-EGFP הממוינים. בצע את מבחני ההתפשטות במהלך שבעת הימים הבאים על תאי גידול ממוינים המצופים בלוחית בעלת 96 בארות באמצעות ציטומטר אוטומטי מבוסס תמונה.
הכתימו את התאים בקרסים ובצבעי פרופידיום יודיד וצלמו את התמונות של התאים באמצעות קורא לוחות אוטומטי כדי לספור את מספר התאים החיים והמתים בכל באר. לבודד RNA כולל מתאי גידול ממוינים באמצעות חומצה סטנדרטית guanidinium phenol ושיטה מבוססת כלורופורם. פתח את התוכנה כדי לבצע את יישור רצף ה- RNA לאחר השלבים הספציפיים לתוכנית באמצעות הגדרות ברירת המחדל.
בחר את שיטת הניתוח, חפש RNA ולאחר מכן בחר את גנום הייחוס של העכבר. העלה את קובץ BED אם הוא מסופק על-ידי ליבת הריצוף. העלה את קבצי הריצוף של FASTQ והקצה שמות משוכפלים ייחודיים לקבצים.
קבץ לשכפל את קבצי FASTQ ולייעד את הקבצים לערכת שכפול. כדי שהניתוח הסטטיסטי והנורמליזציה יזהה את אותות ביטוי הגנים הדיפרנציאליים בעוצמה סטטיסטית חזקה, פתח את תוכנת הניתוח ובחר בקבצי GFP FASTQ כמערכת נתוני הבקרה. לאחר מכן, בחר DESeq2 כשיטת הסטטיסטיקה והנורמליזציה והתחל את ההרכבה והניתוח.
השתמש בערכות הנתונים האונטולוגיות של הגנים המשולבות בכלי ניתוח ההעשרה הפונקציונלית בגישה פתוחה כדי לבצע את ניתוח ההעשרה הפונקציונלית על ה- DEG המתווך Erbb4 בעל מובהקות סטטיסטית שזוהתה כדי לקבוע את המובהקות הביולוגית והמסלולית של אובדן הגן Erbb4. הזריקו את תאי הגידול לעצב הסיאטי של העכבר המרדים כדי להעריך את פוטנציאל הגדילה של in vivo allograft בתאים שלאחר ההדבקה. ברגע שהגידול מגיע לגודל הנדרש, נתחו את הגידול מעכבר מורדם בשניים-שלושה חלקים כפי שהוכח קודם לכן.
לתקן קטע רקמה אחד ב 4% Paraformaldehyde לילה, ולאחר מכן להטמיע את החלק הקבוע בפרפין. לאחר ביצוע מקטעים עבים של חמישה מיקרומטרים מרקמת ה- FFPE, הרכיב את החלק על השקופיות ואישר את נוכחותם של תאי הגידול ברקמה המושתלת באמצעות H&E ו- immunostaining כפי שהוכח בעבר. כדי לאשר את ההבדלים בביטוי in vivo Erbb4 בין שני מצבי הניסוי, הכתימו את הרקמה הקבועה בפורמלין, משובצת פרפין, בנוגדנים ספציפיים ל-Erbb4.
ההעברה של תאי רקמת הגידול של מעטפת העצב ההיקפית הממאירה עם אדנו-וירוס נותחה. התאים המבטאים EGFP זוהו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, והמספר הכולל של התאים נקבע באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה. לאחר אבלציה של גנים בתיווך Cre, בהתאם ליעילות הטרנספקציה, הגנוטיפ PCR הראה נוקאאוט גנים שלם ואוכלוסייה הטרוגנית של תאים מושרים ולא מושרים בהשוואה להתמרת הבקרה.
ההיסטופתולוגיה האופיינית שנמצאה באלוגרפטים האורתטופיים של רקמות גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה בהשוואה לגידולים שנגזרו מהמודלים המקוריים של בעלי חיים מהונדסים גנטית הדגימה הבדל במורפולוגיה של התא. האבלציה של Erbb4 הפחיתה את צפיפות התאים ואת התפשטות התאים בתאי אדנו5-CMV-Cre-אבלציה שולטים בתאים שעברו אדנו5-CMV-GFP. הביטוי של Erbb4 בתאי הגידול שעברו התמרה עם adeno5-CMV-Cre, או נגיף EGFP, פחת בתוצאה של אלוגרפטים מתמרים adeno5-CMV-Cre בהשוואה לגידולי allograft שטופלו על ידי אדנו5-CMV-EGFP.
צפיפות כלי הדם הוערכה באמצעות זיהוי אימונו-ראקטיביות עבור CD31, והתוצאות הייצוגיות הראו ירידה ניכרת בצפיפות כלי הדם באלוגרפטים של תאים שעברו מותמרים אדנו5-CMV-Cre בהשוואה לתאי הבקרה שעברו אדנו5-CMV-EGFP. לאחר אבלציה גנטית, התאים יכולים לשמש עבור סוגים רבים ושונים של בדיקות מבוססות תאים כגון התפשטות, הגירה, גדילה תלת-ממדית או שינויים במיקרו-סביבה, כמו גם עבור זריקות אורתוטופיות in vivo.
