ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לייצר ליסאטים תאי חיידקיים באיכות גבוהה באמצעות ציוד מעבדה משותף זמין רק באופן נרחב, מה שהופך ביטוי גנים ללא תאים נגיש בקלות לרוב החוקרים. שילוב של אוטוליזה תאית של תוכנית עם מחזור הפשרה או ייבוש בהקפאה מאפשר ליצור גישה מעשית, עבודה וחסכונית לייצור מהיר של ליסאטים חיידקיים לביטוי גנים ללא תאים. התחל על ידי שימוש בלולאת חיסון כדי פס התאים של זן E.coli autolysis על לוחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, ולאחר מכן לדגור על הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס בן לילה.

למחרת, באמצעות קצה פיפטה, לבחור מושבה אחת מצלחת אגר ולהוסיף אותו לתוך צינור תרבות המכיל LB בינוני עם אמפיצלין. לגדל את תרבות המתנע הזה ב 37 מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, להוסיף 400 microliters של התרבות המתנע לתוך בקבוקון Erlenmeyer ליטר אחד המכיל 400 מיליליטר של 2xYTPG בינוני בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפצילין.

לדגור על התרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 300 סל"ד. באמצעות ספקטרופוטומטר וקובט אופטי עם אורך נתיב של סנטימטר אחד, מודדים מעת לעת את הצפיפות האופטית של התרבות ב-600 ננומטר. כאשר הצפיפות האופטית עולה על אחת, התחל לדלל את התרבות פי חמישה לפני המדידות כדי להבטיח שהמדידות יישארו בטווח הליניארי של ספקטרופוטומטר מעבדה טיפוסי.

ברגע שהצפיפות האופטית של התרבות מדוללת פי חמישה מגיעה ל-0.3, הסירו את הבקבוק מהחממה והמשיכו להכין את הלסאט. כדי להכין את lysate, לקצור את התאים על ידי centrifugation ב 1, 800 x g במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. יוצקים את supernatant ולהסיר את הנוזל הנותר באמצעות pipette.

מוסיפים 45 מיליליטר של חוצץ S30A קר לכדור ו resuspend הכדור על ידי מערבולת. לאחר מכן, לשקול צינור צנטריפוגה ריק 50 מיליליטר לפני העברת התאים לתוך הצינור. צנטריפוגה התאים שוב ולהשליך את supernatant.

שאפו כל סופר-טבעי שנותר באמצעות פיפטה. שקול את הצינור שוב ולהפחית את המשקל של הצינור הריק מן המשקל המוצג כדי לקבל את המשקל של הכדור. על כל מיליגרם אחד של גלולה תא, להוסיף שני microliters של חוצץ S30A קר בתוספת שני מילימולרים dithiothreitol.

לאחר מכן, תקיף מחדש את התאים על ידי מערבולת נמרצת. לאחר מכן, להקפיא את התאים על ידי הצבתם מינוס 20 או מינוס 80 מעלות צלזיוס מקפיא עד הכדור קפוא ביסודיות, ולאחר מכן להפשיר את התאים באמבט מים בטמפרטורת החדר מערבולת במרץ במשך שתיים עד שלוש דקות. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עם רועד ב 300 סל"ד, ולאחר מכן לנקות את המדגם של פסולת תאית כבדה על ידי צנטריפוגה בצינורות צנטריפוגות שקופים ב 30, 000 x g במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בזהירות להעביר את supernatant לצינור חדש עם pipette, דואג לא להפריע את הכדור. אם supernatant מועבר מזוהם עם חומר מן הכדור, לחזור על צנטריפוגה. מעבירים את הסופר-נט לצינורות צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר.

וצנטריפוגה פעם נוספת ב 21, 000 x g או המהירות המרבית של צנטריפוגה שולחן במשך חמש דקות. Aliquot autolysate אוטומטי לתוך כרכים הרצויים ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד השימוש. לביטוי גנים ללא תאים באמצעות autolysate, לערבב שמונה microliters של autolysate ו 8.9 microliters של מראש לערבב על קרח.

הוסף DNA לריכוז סופי של שמונה ננומולים, כל ריאגנטים ומים נחוצים אחרים כדי להשיג נפח סופי של 20 מיקרוליטרים. הוסף את התגובה למיקרו-לוחית בעלת 384 באר והשתמש בקורא לוחות כדי למדוד את מסלול הזמן והנקודות הקצה של הפלואורסצנטיות. ביטוי GFP באמצעות autolysate עם סדרת דילול של DNA פלזמה תוצאות ביטוי חזק אפילו עם DNA ננומולרי אחד.

בעת השוואת ביטוי GFP בין ליסייט זמין מסחרית ואת autolysate, autolysate המיוצר רמות דומות של GFP. השונות בין קבוצות של ליסאט המיוצר בשתי מעבדות שונות על ידי חוקרים שונים היה בתוך בערך פי שניים. שלושת המשתנים הקריטיים ביותר הם יחס גלולה עד חיץ של תאים, העברת סופר-נט ללא פסולת ושימוש בריכוז PEG ומגנזיום אופטימלי בתגובה הסופית.

לאחר שהתמצית הוכנה, ניתן להשתמש בארסנל גדול של פרוטוקולים קיימים שפותחו עבור מערכות ביטוי חופש תא E.coli, כגון השפלה בתיווך ClpXP, או חישת מניין בתיווך AHL.