Используя этот протокол, высококачественные бактериальные клеточные лизаты могут быть получены с использованием только широко доступного общего лабораторного оборудования, что делает бесклеточную экспрессию генов легко доступной для большинства исследователей. Сочетание программного клеточного аутолиза с циклом замораживания-оттаивания или сублимационной сушки позволяет создать практичный, трудоемкий и экономически эффективный подход к быстрому производству бактериальных лизатов для бесклеточной экспрессии генов. Начните с использования петли инокуляции, чтобы протянуть клетки аутолизного штамма E.coli на пластины агара LB, содержащие 50 микрограммов на миллилитр ампициллина, а затем инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия в течение ночи.
На следующий день, используя наконечник пипетки, выберите одну колонию из агаровой пластины и добавьте ее в культуральную трубку, содержащую среду LB с ампициллином. Выращивайте эту заквасочную культуру при температуре 37 градусов по Цельсию в течение ночи. На следующий день добавьте 400 микролитров закваски в литровую колбу Эрленмейера, содержащую 400 миллилитров среды 2xYTPG, дополненную 50 мкг на миллилитр ампициллина.
Инкубировать культуру при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием при 300 об/мин. Используя спектрофотометр и оптическую кювету длиной в один сантиметр, периодически измеряйте оптическую плотность культуры на уровне 600 нанометров. Когда оптическая плотность превысит единицу, начните разбавлять культуру в пять раз перед измерениями, чтобы гарантировать, что измерения остаются в линейном диапазоне типичного лабораторного спектрофотометра.
Как только оптическая плотность пятикратной разбавленной культуры достигнет 0,3, извлеките колбу из инкубатора и приступайте к приготовлению лизата. Для приготовления лизата собирают клетки методом центрифугирования при 1 800 х г в течение 15 минут при комнатной температуре. Вылейте супернатант и удалите оставшуюся жидкость с помощью пипетки.
Добавьте 45 миллилитров холодного буфера S30A в гранулу и повторно суспендируйте гранулу путем вихря. Затем взвесьте пустую 50-миллилитровую центрифужную трубку, прежде чем переносить клетки в трубку. Центрифугируйте клетки снова и выбросьте супернатант.
Аспирируйте любой оставшийся супернатант с помощью пипетки. Снова взвесьте трубку и вычтите вес пустой трубки из веса, отображаемого для получения веса гранулы. На каждый миллиграмм клеточной гранулы добавляют два микролитра холодного буфера S30A, дополненного двумя миллимолярными дитиотрейтолами.
Затем повторно суспендируйте клетки путем энергичного вихря. Затем заморозьте клетки, поместив их в морозильную камеру с отрицательным 20 или отрицательным 80 градусами Цельсия до тех пор, пока гранула не будет тщательно заморожена, затем разморозьте клетки на водяной бане комнатной температуры и энергично вихрейте в течение двух-трех минут. Инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия в течение 45 минут с встряхиванием при 300 об/мин, затем очищают образец от тяжелого клеточного мусора путем центрифугирования в прозрачных центрифужных трубках при 30 000 х г в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия.
Осторожно перенесите супернатант в новую трубку с пипеткой, следя за тем, чтобы не потревожить гранулу. Если перенесенный супернатант загрязнен материалом из гранулы, повторите центрифугирование. Перенесите супернатант в 1,5-миллилитровые центрифужные трубки.
И центрифуга еще раз на 21 000 х г или максимальная скорость настольной центрифуги в течение пяти минут. Aliquot очищенный автолизат в нужные объемы и хранить при минус 80 градусах Цельсия до использования. Для бесклеточной экспрессии генов с использованием автолизата смешайте восемь микролитров автолизата и 8,9 микролитра предварительного смешивания на льду.
Добавьте ДНК к конечной концентрации восьми наномолей, любых других необходимых реагентов и воды для получения конечного объема в 20 микролитров. Добавьте реакцию к 384-луночной микропластине и используйте считыватель пластин для измерения хода времени флуоресценции и конечных точек. Экспрессия GFP с использованием аутолизата с разбавлением серии плазменной ДНК приводит к сильной экспрессии даже с одной наномолярной ДНК.
При сравнении экспрессии GFP между коммерчески доступным лизатом и автолизатом автолизат получал сопоставимые уровни GFP. Изменчивость между партиями лизата, произведенного в двух разных лабораториях разными исследователями, была примерно в два раза. Тремя наиболее важными переменными являются отношение клеточных гранул к буферу, перенос супернатанта без мусора и использование оптимальной концентрации ПЭГ и магния в конечной реакции.
После того, как экстракт был подготовлен, можно использовать большой арсенал существующих протоколов, разработанных для систем экспрессии без клеток E.coli, таких как ClpXP-опосредованная деградация или AHL-опосредованное восприятие кворума.
