En utilisant ce protocole, des lysats de cellules bactériennes de haute qualité peuvent être produits en utilisant uniquement des équipements de laboratoire courants largement disponibles, ce qui rend l’expression génique sans cellules facilement accessible à la plupart des chercheurs. La combinaison de l’autolyse cellulaire programmée avec un cycle lyophilisation-décongélation ou lyophilisation permet de créer une approche pratique, laborieuse et rentable pour la production rapide de lysats bactériens pour l’expression génique sans cellule. Commencez par utiliser une boucle d’inoculation pour strier les cellules d’une souche d’E. coli d’autolyse sur des plaques de gélose LB contenant 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline, puis incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, à l’aide d’une pointe de pipette, choisissez une seule colonie dans la plaque de gélose et ajoutez-la dans un tube de culture contenant un milieu LB avec de l’ampicilline. Cultivez cette culture de démarrage à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez 400 microlitres de la culture de démarrage dans une fiole d’Erlenmeyer d’un litre contenant 400 millilitres de milieu 2xYTPG complété par 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline.
Incuber la culture à 37 degrés Celsius en secouant à 300 tr / min. À l’aide d’un spectrophotomètre et d’une cuvette optique d’une longueur de trajet d’un centimètre, mesurez périodiquement la densité optique de la culture à 600 nanomètres. Lorsque la densité optique dépasse un, commencez à diluer la culture cinq fois avant les mesures pour vous assurer que les mesures restent dans la plage linéaire d’un spectrophotomètre de laboratoire typique.
Une fois que la densité optique de la culture quintuple diluée atteint 0,3, retirez la fiole de l’incubateur et procédez à la préparation du lysat. Pour préparer le lysat, prélèvez les cellules par centrifugation à 1 800 x g pendant 15 minutes à température ambiante. Versez le surnageant et retirez le liquide restant à l’aide d’une pipette.
Ajouter 45 millilitres de tampon S30A froid à la pastille et remettre la pastille en suspension par vortex. Ensuite, pesez un tube de centrifugeuse vide de 50 millilitres avant de transférer les cellules dans le tube. Centrifugez à nouveau les cellules et jetez le surnageant.
Aspirer tout surnageant restant à l’aide d’une pipette. Pesez à nouveau le tube et soustrayez le poids du tube vide du poids affiché pour obtenir le poids de la pastille. Pour chaque milligramme de pastille cellulaire, ajoutez deux microlitres de tampon S30A froid complété par deux millimolaires de dithiothréitol.
Ensuite, ressuspendez les cellules par un vortex vigoureux. Ensuite, congelez les cellules en les plaçant dans un congélateur négatif de 20 ou 80 degrés Celsius jusqu’à ce que la pastille soit complètement congelée, puis décongelez les cellules dans un bain-marie à température ambiante et un vortex vigoureusement pendant deux à trois minutes. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes en agitant à 300 tr / min, puis nettoyer l’échantillon de débris cellulaires lourds en centrifugant dans des tubes centrifuges transparents à 30 000 x g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius.
Transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube avec une pipette, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Si le surnageant transféré est contaminé par un matériau provenant de la pastille, répétez la centrifugation. Transférer le surnageant dans des tubes centrifuges de 1,5 millilitre.
Et centrifugez une fois de plus à 21 000 x g ou la vitesse maximale d’une centrifugeuse de table pendant cinq minutes. Aliquotez l’autolysat dégagé dans les volumes souhaités et stockez à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour l’expression génique sans cellules à l’aide de l’autolysat, mélanger huit microlitres d’autolysat et 8,9 microlitres de prémélange sur glace.
Ajouter de l’ADN à une concentration finale de huit nanomoles, tout autre réactif nécessaire et de l’eau pour obtenir un volume final de 20 microlitres. Ajoutez la réaction à une microplaque de 384 puits et utilisez un lecteur de plaque pour mesurer le cours du temps de fluorescence et les extrémités. L’expression de GFP à l’aide de l’autolysat avec une série de dilution d’ADN plasmatique donne une expression forte même avec un ADN nanomolaire.
En comparant l’expression de GFP entre un lysat disponible dans le commerce et l’autolysat, l’autolysat a produit des niveaux comparables de GFP. La variabilité entre les lots de lysat produits dans deux laboratoires différents par des chercheurs différents était d’environ deux fois. Les trois variables les plus critiques sont le rapport granulé cellulaire/tampon, le transfert d’un surnageant sans débris et l’utilisation d’une concentration optimale de PEG et de magnésium dans la réaction finale.
Une fois l’extrait préparé, un large arsenal de protocoles existants développés pour les systèmes d’expression sans cellules E. coli peut être utilisé, tels que la dégradation médiée par ClpXP ou la détection du quorum médiée par AHL.
