השיטה שלנו מאפשרת אפיון מהיר של חלקים גנטיים באמצעות מערכות ביטוי ללא תאים ו-PCR במקום שיבוט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מה שבדרך כלל לוקח ימים עד שבועות בתאים, ניתן לעשות זאת תוך שעות עד ימים בשיטה זו. הפרוטוקול שלנו כולל שלבים ליצירת מערכות ביטוי ללא תאים משלך, שיכולות להיות מסובכות במספר מקומות ועשויות לדרוש התאמות בהתאם למקרה השימוש.
בתחילת הדרך, אנו ממליצים להתחיל עם ערכות מסחריות. התחילו בהכנת תערובת מאסטר PCR בהתאם להוראות בכתב היד ואחסנו אותה על קרח. Aliquot 30 או 40 מיקרוליטר של תערובת האב למספר שנקבע של צינורות PCR ולהוסיף 10 מיקרוליטר של כל חמישה פריימרים משתנים מיקרומולרים לצינורות PCR מסומנים כראוי.
הכנס את צינורות ה- PCR ל- thermocycler והפעל את תוכנית ה- PCR כפי שהוזכר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, החזיקו את התגובות בארבע מעלות צלזיוס. אם התבנית המקורית היא DNA פלזמה, הוסף מיקרוליטר אחד של אנזים הגבלת DpnI כדי לעכל את התבנית המקורית ולדגור על התגובות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לנתח חמישה מיקרוליטר של כל מוצר PCR על ידי הפרדתם באמצעות ג'ל agarose 1% ב 180 וולט במשך 20 דקות. בדוק את גודל הרצועה הנכון, אשר ישתנה עם רצף הליבה שנבחר ואת אורך החלקים שנוספו. טהרו את התבניות הליניאריות באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרית.
אם היו מספר רצועות על ידי אלקטרופורזה בג'ל, הוציאו את הפסים המעניינים מהג'ל וטיהרו את הדנ"א באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. כמת כל תבנית DNA באמצעות ספקטרופוטומטר, הערכת איכותה על ידי בדיקה שהיחס בין 260 ל -280 ננומטר הוא בערך 1.8. מפשירים את כל המרכיבים על קרח ומכינים תערובת מאסטר על ידי ערבוב יסודי של כל המרכיבים עם פיפטה, כפי שמוזכר בכתב היד.
שימו לב היטב כדי למנוע משקעים, במיוחד עבור תערובת חומצות אמינו. שומרים את תערובת האב על קרח. מצננים צלחת של 384 בארות על קרח ומפזרים את תערובת המאסטר באליציטוטים של תשעה מיקרוליטר לכל באר.
הפשירו את חלבון המדכא על קרח והפיצו אותו לצלחת מקור אקוסטית לטיפול בנוזל, תוך הבטחת הכמות המתאימה של נפח מת הנדרשת לסוג צלחת המקור בה נעשה שימוש. פזרו את חלבון המדכא בנפחים של מיקרוליטר אחד לבארות היעד המתאימות באמצעות המטפל בנוזלים. כלול דילול סדרתי של המדווח המטוהר או תקן כימי מתאים על הצלחת כדי להשוות תוצאות עם מחקרים אחרים ומעבדות אחרות.
בחר טווח ריכוזים המתאים לכתב המשמש בטווח הביטוי הצפוי של הניסויים. מחממים מראש את קורא הצלחות ל-30 מעלות. במידת האפשר, על המכשיר, להגדיר שיפוע טמפרטורה אנכי של מעלה אחת צלזיוס כדי להגביל את העיבוי על האטם.
הגדר את קורא הלוחות לקריאה בהגדרות המתאימות לכתב המשמש ברצף הליבה, מבלי לרעוד צעדים. אטמו את הצלחת בעלת 384 הבארות באטם פלסטיק בלתי חדיר למניעת אידוי. הניחו את הצלחת בעלת 384 הבארות על מחזיק הצלחת והתחילו לקרוא.
15 תבניות ליניאריות, הנבדלות רק במרחק של מקדם T7 ביחס לרצף ה-tetO, הוכנו על ידי PCR, והעצימו את כתב-החלבון הפלואורסצנטי הירוק, עם פריימרים שנועדו להוסיף כל גרסה של מקדם. ניתוח נתונים מ-540 תגובות עבור כל קבוצת צירופי T7 tetO הראה כי ה-T7 RNA פולימראז מווסת את הביטוי מונחה T7 באופן שווה, עד 13 זוגות בסיסים במורד הזרם מתחילת תעתיק T7. חלוקה עקבית יותר על פני סדרה של שמונה בארות יעד באמצעות מטפל הנוזלים האקוסטי נצפתה כאשר העברה של חמישה מיקרוליטר חולקה למתקנים נפרדים של מיקרוליטר אחד.
ניתן להשתמש בפרוטוקול שלנו כדי לסנן במהירות רכיבים גנטיים, בין אם לצורך סינון של ביו-חיישנים חדשים או בניית ספריות של חלקים גנטיים.
