Name: fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus
Uploaded: 2017-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענק-NIH #SC1AI109055, גרנט NMSU HHMI #52008103 2014, ו NSF PGR להעניק #1238731. אנו מודים המשתתפים של NMSU האביב 2015 BIOL302 מולקולרית שיטות מחלקה, בבהאטיה Lavesh לתמיכה טכנית שלהם עם הניסויים תרבות הגוף השמן.

1-הכנת ריאגנטים והפתרונות <ol><li>פתרון מניות חומצת אמינו <ol><li>הכן 4 X חומצת אמינו פתרון מניות 23 , 24 ידי שקילה, הוספת את 20 חומצות אמינו שונות הבקבוק Erlenmeyer על פי ריכוז נתון טבלה 1- 
		הערה: במקרים מסוימים, amino acid(s) יכול להיות מהפתרון והוחלף שווה טוחנת כמויות של מניטול לשמור על ריכוז שווה של osmolytes.</li>
		<li>להוסיף את הכמות המתאימה של ddH 2 O לייצר האחסון הרצוי של פתרון.</li>
		<li>על מנת להבטיח כי חומצות אמינו יש התפרקה לחלוטין, מחממים בעדינות תוך כדי ערבוב מתמיד עד שהנוזל נקי לחלוטין; הוא יקבל גוון צהוב קלה. 
		הערה: זה עשוי להיות נחוץ לצמצם את רמת ה-pH 6 על-ידי הוספת HCl כדי לאפשר כמה חומצות אמינו הידרופוביות יותר להתמוסס.</li>
		<li>Aliquot הפתרון וסינון סטרילי-באמצעות מסנן מזרק 0.2-µm גודל הנקבוביות.</li>
		<li>חנות במיכל אטום ב-20 ° C עד 6 חודשים.</li>
	</ol></li> <li>APS הערה: לראות 25.
	<ol><li>עבור 20 X מלח פתרון מניות, לשלב המלחים המפורטים בטבלה מס ' 2 ב- 50 מ ל מים. מערבבים עד התפרקה לחלוטין. 
		הערה: ייתכן צורך לחמם מעט לפתרון נמסים לחלוטין המלחים.</li>
		<li>סטרילי-מסנן באמצעות מסנן מזרק 0.2-מיקרומטר גודל הנקבוביות ולאחסן את הפתרון בשפופרת 50-mL ב-20 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>פתרון מניות סידן <ol><li>עבור 50 X פתרון מניות סידן, להוסיף 0.90 גר' סידן כלורי 100 מ ל מים (טבלה 3); ומערבבים עד התפרקה לחלוטין.</li>
		<li>סטרילי-מסנן באמצעות מזרק לסנן עם גודל הנקבוביות 0.2-מיקרומטר, aliquot את הפתרון לתוך צינורות 50-mL, ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>טריס מאגר (pH 7.4) <ol><li>עבור מאגר טריס, לשלב את המלח ואת הפתרונות המפורטים בטבלה 4 ולהוסיף ddH 2 O עד 100 מ ל.</li>
		<li>סטרילי-מסנן באמצעות מזרק לסנן עם גודל הנקבוביות 0.2-מיקרומטר, aliquot את הפתרון לתוך צינורות 50-mL; לאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li> <li>בינוני תרבות הגוף השמן <ol><li>כדי להכין המדיום תרבות הגוף השמן, להכין כל הפתרונות המפורטים לעיל.</li>
		<li>לשלב אותם לפי אמצעי האחסון טבלה 5 לעשות 200 מ של תרבות הגוף השמן בינונית.</li>
		<li>להתאים את ה-pH ל 7.2 באמצעות NaOH או HCl.</li>
		<li>מסנן סטרילי הפתרון באמצעות מסנן מזרק עם גודל הנקבוביות 0.2-מיקרומטר.</li>
		<li>לחלק את הפתרון aliquots 15-mL ולאחסן ב-20 ° C עד 6 חודשים.</li>
	</ol></li></ol> 2. הכנות לקראת ניתוח <ol><li>להכין את stereomicroscope (10-20 x הגדלה) עם תאורה ופרוס שני פינצטה ultra-בסדר, זוג מספריים ניתוח מיקרו-</li>
	<li>להכין את כל הפתרונות הדרושים לניסוי. להפשיר את המדיום תרבות הגוף השמן לטמפרטורת החדר. 
	הערה: Precipitants יכול להיות מומס על ידי חימום בעדינות את הפתרון לא יותר מ-30 מעלות צלזיוס</li>
	<li>העצמות, לאסוף את היתושים הבוגרים הנשי (3-7 ימים לאחר הופעתה), עזים ומתנגד אותם באמצעות פחמן דו-חמצני או קרח 
	הערה: פעם מרדימים, היתושים יש לשמור תחת CO 2 בזמן הקצר ביותר האפשרי, שלא יעלה על 20 דק. לחלופין, היתושים יכול להיות מורדם על הקרח שמרה במשך כ-30 דקות</li>
	<li>להכין צלחת 6-ובכן עם 3 מ"ל של APS לכל טוב.</li>
</ol> 3. חיתוך שומן הגוף <ol><li>למקד את stereomicroscope ויבתר ולהתאים את הכיסא לגובה נוח.</li>
	<li>למקם שקופית קעורה מיקרוסקופ על פני מיקרוסקופ, להוסיף 2 טיפות APS למרכז.</li>
	<li>לאסוף יתוש על ידי רגל באמצעות מלקחיים ולהעביר אותה אל פני השטח APS בשקופית מיקרוסקופ.</li>
	<li>בקפידה אחיזה היתוש מאת בית החזה, עם המלקחיים ביד שמאל, וסובב היתוש כך הצד הבטני היא כלפי מעלה.</li>
	<li>תוך החזקת הגוף יציב על-ידי בית החזה, את שני מקטעי בטן, עם המלקחיים ביד ימין, ומשוך בעדינות. 
	הערה: לאחרונה שני מגזרים בטן יפריד הבטן השחלות המצורפת, Malpighian בקוריאנית, hindgut, ואת פיתול; לפעמים היבול יהיה להחליק החוצה הבטן. אם הן לא הוסרו, הכנס את קצות המלקחיים סגורה לתוך החור קטן שנוצר ולהסיר את הרקמות הנותרים.</li>
	<li>להפריש את המלקחיים נכון ולקחת את המספריים האביב. החלק סכין אחד לתוך החור בבטן עד המקטע להלן בית החזה. בעדינות ובמהירות לחתוך את הבטן לאורכו. 
	הערה: לאחר ביצוע החתך, הבטן צריך להתחיל להרחיב כלפי חוץ, אבל זו לא תיתכן מיד.</li>
	<li>להמשיך לבצע גזירה שנייה, אשר יהיה חתך לרוחב מתחת בית החזה, מעט מתחת שבו החתך הראשון הסתיים. 
	הערה: הבטן כדאי לפתוח ואז מביצועם מבית החזה, את הקוטיקולה למעלה והגופים שמן הצד-שקוע בתוך גישה. הקיר גוף הבטן היא הכנת הגוף השמן לתרבות במבחנה.</li>
	<li>להרים את הגופות שומן מהפתרון APS משתמש הקצה של זוג מלקחיים ולהעביר אותם מהפתרון לצלחת 6-ובכן המכיל APS בטמפרטורת החדר. לאפשר את הרקמה כדי לנוח כ 0.5 h לפני קידום לתרבות הגוף השמן.</li>
</ol> 4. תרבות הגוף השמן <ol><li>דגירה הגופים שומן ב- APS בטמפרטורת החדר במשך לפחות 0.5 h כדי equilibrate אותם.</li>
	<li>העברת הגופות שומן באמצעות הקצה של המלקחיים והרם אותם בעדינות מתוך הפתרון APS. הנמך את הטיפ אל המדיום תרבות הגוף השמן. 
	הערה: לגוף שומן צריך לפתוח על פני השטח של המדיום, מרחפים בחופשיות. תרבות הגוף השמן מבוצעת בדרך כלל בתוך צלחות 96-ובכן, עם 150-200 µL בינוני היטב בכל. ובכן משתלבים אחד עד שלושה בודדים גופות שומן, והם קיימא עבור יותר מ 12 שעות (שלא פורסמו תוצאות אישי).</li>
	<li>לאחר תקופת דגירה, להעביר את הגופות שומן של המדיום לתוך צינורות 1.5-mL צנטריפוגה המכיל את ריאגנטים המתאים לעיבוד הזרם. 
	הערה: ניתוחים טיפוסיים כוללים qPCR 16 , 17 , 18 , 19, ווסטרן סופג 18 , 20, transcriptomics 26, פרוטאומיקס 21 או גליקומיקס 22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Benelli, G., Mehlhorn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declining+malaria,+rising+of+dengue+and+Zika+virus:+insights+for+mosquito+vector+control.">Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control.</a> Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).</li><li>Newby, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+to+eradication:+a+progress+report+on+the+malaria-eliminating+countries.">The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries.</a> Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).</li><li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).</li><li>Long, C. A., Zavala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+vaccines+and+human+immune+responses.">Malaria vaccines and human immune responses.</a> Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).</li><li>Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immune+responses+against+sexual+stages+of+malaria+parasites:+considerations+for+malaria+vaccines.">Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines.</a> Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).</li><li>Frings, S., Lindemann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+response+of+isolated+olfactory+receptor+cells+is+blocked+by+amiloride.">Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride.</a> J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).</li><li>Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GABAergic+inhibition+on+odorant+concentration+coding+in+mushroom+body+intrinsic+neurons+of+the+honeybee.">Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).</li><li>Yewhalaw, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+insecticide+resistance:+an+impediment+to+insecticide-based+malaria+vector+control+program.">Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program.</a> PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).</li><li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+fat+body:+energy,+metabolism,+and+regulation.">Insect fat body: energy, metabolism, and regulation.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).</li><li>Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W., Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. , 507-522 (1997).</li><li>Price, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fat+body+transcriptomes+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti,+pre-+and+post-+blood+meal.">The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal.</a> PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-way+regulation+of+mosquito+yolk+protein+precursor+genes+by+juvenile+hormone-,+ecdysone-,+nutrient-,+and+insulin-like+peptide+signaling+pathways.">Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways.</a> Front Physiol. 5, 103 (2014).</li><li>Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+yolk+proteins+in+insect+oocytes.">Accumulation of yolk proteins in insect oocytes.</a> Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).</li><li>Raikhel, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+mosquito+vitellogenesis:+from+basic+studies+to+genetic+engineering+of+antipathogen+immunity.">Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity.</a> Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Chandrasekar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+6.">Ch. 6.</a> Short Views on Insect Molecular Biology. , (2009).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-mediated+amino+acid+signaling+in+mosquito+anautogeny.">Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-dependent+activation+of+S6+kinase+is+a+central+step+in+the+transduction+of+nutritional+signals+during+egg+development+in+a+mosquito.">Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+cationic+amino+acid+transporters+required+for+nutritional+signaling+during+mosquito+reproduction.">Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction.</a> J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).</li><li>Carpenter, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC7+amino+acid+transporters+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti+and+their+role+in+fat+body+TOR+signaling+and+reproduction.">SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction.</a> J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).</li><li>Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+knockdown+of+a+GATA+factor+reveals+a+link+to+anautogeny+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).</li><li>Hugo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+biomarkers+for+ageing+the+mosquito+Aedes+aegypti+to+determine+risk+of+pathogen+transmission.">Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission.</a> PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).</li><li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+mosquitoes,+large+implications:+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti.">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasit Vectors. 8, 252 (2015).</li><li>Uchida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+oogenesis+in+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+by+infusion+of+the+hemocoel+with+amino+acids.">Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids.</a> J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).</li><li>Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+free+amino+acid+concentration+in+the+hemolymph+of+the+female+Culex+pipiens+pallens+(Diptera:+Culicidae),+after+a+blood+meal.">Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal.</a> J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).</li><li>Hayes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+a+physiological+saline+solution+for+Aedes+aegypti+.(L).">Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L).</a> J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).</li><li>Price, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fat+Body+Transcriptomes+of+the+Yellow+Fever+Mosquito+Aedes+aegypti,+Pre-+and+Post+Blood+Meal.">The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal.</a> Plos One. 6 (7), e22573 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+technical+reports.+Modification+of+the+TRI+reagent+procedure+for+isolation+of+RNA+from+polysaccharide-and+proteoglycan-rich+sources.">Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources.</a> Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).</li><li>Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+odorant+concentration+dependent+inhibition+controls+temporal+properties+of+spike+responses+of+projection+neurons+in+the+moth+antennal+lobe.">Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe.</a> PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).</li><li>Larsen, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+in+an+insect+organ+culture.">Growth in an insect organ culture.</a> J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).</li><li>Judy, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Structure,+and+Absolute+Configuration+of+a+New+Natural+Insect+Juvenile+Hormone+from+Manduca+sexta.">Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).</li><li>Marks, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+hormones+in+insect+cell+and+organ+cultures.">The action of hormones in insect cell and organ cultures.</a> Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).</li><li>Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+Wolbachia+into+Anopheles+and+Other+Insect+Germlines+in+an+Ex+vivo+Organ+Culture+System.">Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System.</a> PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).</li><li>Postlethwait, J. H., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Juvenile-Hormone+and+20-Hydroxy-Ecdysone+during+Vitellogenesis+in+Isolated+Abdomens+of+Drosophila+melanogaster.">Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster.</a> J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).</li><li>Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone-initiated+ovarian+development+in+mosquitoes.">Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes.</a> J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).</li><li>Boudko, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+transport+mechanism+of+amino-acid+transceptor+Slimfast+from+Aedes+aegypti.">Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti.</a> Nat Commun. 6, 8546 (2015).</li><li>Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+odorant+receptor+Olfr78+in+enteroendocrine+cells+of+the+colon.">Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon.</a> Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).</li><li>Jones, K. H., Senft, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+determine+cell+viability+by+simultaneous+staining+with+fluorescein+diacetate-propidium+iodide.">An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide.</a> J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).</li></ol>

אין לנו לחשוף.

איברים חרקים התרבות היה בשימוש נרחב ללמוד אנדוקרינולוגיה חרקים, פיתוח, חילוף החומרים, כמו גם כדי לחקור את האינטראקציה בין איברים מסוימים אנחנו חיים איתם בסמביוזה חיידקי29,30,31, 32,33,34. In vitro לקשרי תרבות איבר הגוף השמן שימש במיוחד ללמוד חומצת אמינו תחבורה והסדרה של חלמון ייצור החלבון יתושים ואת שאר Diptera16,17,35 , 36. במהלך התהליך של vitellogenesis, יתוש שומן הגוף משתמש מערך של חומצת אמינו גבוהה-ירידה לפרטים מובילי לייבוא נגזר ארוחת דם חומצות אמינו hemolymph לסנתז כמויות גדולות של חלבונים חלמון12 ,19,35,36. תרבות הגוף השמן היה לכלי התיחום של הדרישות התזונתיות של הגוף השמן הזה בהקשר18.
איכות חומר המוצא, היתושים נקבה, היא קריטית להצלחת הניסויים. רימות היתוש העולות צפופות תחת תנאים וניזונו התזונתי גבוה דיאטות בדרך כלל לייצר את התוצאות הטובות ביותר. יש כמה משתנים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת יצירת תנאים תרבות הגוף השמן יתושים במעבדה מבחינת עיצוב ניסיוני. הראנו במחקרים קודמים, ביטוי גנים שומן הגוף משתנה באופן משמעותי בהתאם כל סיפור חיי הפרט ואת המצב התזונתי של יתוש11,22. התנאים התרבות יתוש צריך להיות אחיד כדי להפחית את מידת ההשתנות בגודל, עתודות התזונתיים של היתושים ניסיוני. בנוסף, אנשי ביצוע והניתוחים בקיצור כדי להבטיח ניתוח מהיר ומדויק עם תוצאות עקביות. תא הכדאיות בגופים שומן מבודדים ניתן לבדוק באמצעות שונים מכתימים שיטות37,38.
הנבחנים של ניסוי תרבות הגוף השמן צריך לקחת בחשבון מספר והניתוחים אפשרי בתקופת זמן נתונה. כאשר נדרשים כמויות גדולות של שומן הגוף, הפעלות לנתיחה מרובות או dissectors מרובים ייתכן שיהיה צורך. יש מגוון רחב של יישומים עתידיים עבור in vitro לקשרי תרבות הגוף השמן בבית. יתושים וחרקים אחרים. זה יהיה שימושי במיוחד עבור בדיקות מועמדים פוטנציאליים סמים לבקרת מזיקים. השימוש בטכניקות הטרנסגניים בחרקים לבטא חלבונים ספציפיים כתב ב הגוף השמן trophocytes יפתח את שיטות חדשות כדי לפתח bioassays עוצמה עבור חקר הפיזיולוגיה של הגוף השמן.

היתושים הם וקטורים של מחלות האדם הרסנית, לרבות מלריה, קדחת דנגה, chikungunya Zika1,2,3. למרות אינטנסיבי המאמצים הבינלאומיים לרסן מחלות אלה וכדי לשלוט להעברת המחלה אוכלוסיות יתוש, התפרצות מגפת המחלות בעקיצות יתוש הן עדיין נפוץ, במיוחד במדינות מתפתחות. חיסונים יעילים נגד רבים של מחלות אלו הן אינו זמין או של יעילות מוגבלת4,5. הדרך היעילה ביותר למנוע התפרצויות היא לשלוט אוכלוסיות יתוש, בעיקר באמצעות שימוש בקוטלי חרקים טיפולים. עם זאת, עמידות חרקים יש שפותחה אוכלוסיות יתושים רבים ולהיות בעיה נפוצה ברחבי העולם6,7,8. המחקר של יתוש פיזיולוגיה חיוני להתפתחות של הרומן כלים ואסטרטגיות כדי לשלוט במחלה.
יתוש שומן הגוף ממלאת תפקיד מרכזי לאחסון מזון, הומאוסטזיס מטבולית, רבייה, קטבוליזם xenobiotic9,10,11,12. זה האיבר האחסון המרכזי עבור טריגליצרידים, גליקוגן וחומצות אמינו בצורה של חלבוני. הוא מתפקד גם המיקום של סינתזה עבור רוב החלבונים hemolymph של מטבוליטים. יתושים, שומן הגוף הוא המקור הבלעדי של ייצור החלבון חלמון המתרחשת אצל נקבות לאחר שהם לוקחים ארוחת דם13,14.
סוג התא העיקרי של שומן הגוף הוא גדול, polyploid trophocyte או adipocyte3,9,10,12. רקמת שומן גוף שמאורגנים אונות או עטיפות, ניתן למצוא כל חלקי הגוף של היתוש, עם החלק הגדול ביותר ממוקם בבטן, איפה אונות גדולה של שומן הגוף מחוברים לקיר הבטן הגוף.
מערכת תרבות הגוף השמן יתושים המובאת כאן פותחה בשנות ה-70 ונותרה כלי רב עוצמה עבור לומד הגוף השמן פיזיולוגיה10, במיוחד בשילוב עם טכנולוגיות אנליזה הנוכחית. הבסיס של טכניקה זו מבוססת על בידודו של הקירות גוף הבטן ואת הרקמה המשויך שומן הגוף. מהות הידרופובי הקוטיקולה הבטן גורם לו לצוף על פני השטח של המדיום תרבות, עם האונות המצורפת של הגוף השמן בטן שקועה. Spiracles ואת המבנה tracheolar נשמרים, הבטחת חמצון של בתרבית רקמה. מעתה ואילך, נתייחס ההכנות הללו "שומן גופות." בודדים גופות שומן נשארות קיימא עבור יותר מ 12 שעות כאשר מתפשט בתוך המדיום המתאים (שלא פורסמו תוצאות). תרבות הגוף השמן הוא כלי בעל ערך יש לטפל בהן מגוון של שאלות לגבי הגוף השמן אנדוקרינולוגיה ופיזיולוגיה9,10,12,15,16, 17.
בתרבית שומן הגוף יכולה להיות נתונה שונות ניסיוני ושליטה טיפולים, העיתוי של אשר יכול להיות הוחלט על ידי החוקר. בסוף תקופת הדגירה, הגופים שומן ניתן לאסוף ולהשתמש מעובד עבור ניתוחים במורד הזרם, כולל qPCR16,17,18,19, ווסטרן סופג18 ,20, פרוטאומיקס21או גליקומיקס22. ניתן לבצע ניסויים על סולמות שונים, מ בודדים גופות שומן לקבוצות של מאות זה יכול להיות תרבותי ביחד.
התוצאות נציג כלולים כאן נגזר שומן גוף תרבותי בנוכחות חומצות אמינו ו ecdysone הידרוקסי 20 של הורמונים סטרואידים כדי לדמות את ההפעלה ארוחת דם של16,vitellogenesis17, 23,24. אנו מנותח, בהשוואה בביטוי הגן דיפרנציאלית של לא מופעל נגד גופים שומן מופעל באמצעות ניתוח הדור הבא רצפי.

<table><tbody><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fiskars</td><td>83872</td><td></td></tr><tr><td>Fly pad</td><td>Genesee Scientific</td><td>789060</td><td></td></tr><tr><td>Battery-powered aspirator w/ collection vial</td><td>Hausherrs Machine Works, Inc.</td><td>3740-01-210-2368</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip forceps</td><td>World Precision Instruments, Inc.&amp;nbsp;</td><td>500085</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well plate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CL S3383</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Alanine</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>Arginine</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>Asparagine</td><td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>Aspartic Acid</td><td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Glutamic Acid</td><td>Sigma</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>Isoleucine</td><td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Phenylalanine</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>Serine</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>Threonine</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophan</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Valine</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Methionine</td><td>Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH8.0&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus

שומן הגוף חרקים ממלאת תפקיד מרכזי חילוף החומרים חרקים, אחסון מזון, שיקוף פונקציות של הכבד, רקמת שומן חולייתנים. רקמות הגוף השמן חרקים מופץ בדרך כלל בכל הגוף חרקים. עם זאת, לעיתים קרובות מרוכז בבטן, מחובר לקיר הגוף בבטן.
יתוש שומן הגוף הוא המקור הבלעדי של חלמון חלבונים, אשר הם קריטיים עבור ייצור הביצים. לכן, התרבות במבחנה של רקמות שומן הגוף יתושים מייצג מערכת חשובה זו לחקר יתושים פיזיולוגיה, חילוף החומרים, ובסופו של דבר, ביצים. התהליך תרבות הגוף השמן מתחיל עם ההכנה של פתרונות, ריאגנטים, כולל פתרונות מניות חומצת אמינו, אאדס תמיסת מלח פיזיולוגית מלח מניות פתרון (APS), פתרון מניות סידן בינוני תרבות הגוף השמן. התהליך ממשיך עם חיתוך שומן הגוף, ואחריו טיפול ניסיוני. לאחר הטיפול, מגוון רחב של ניתוחים שונים ניתן לבצע, כולל RNA רצף (RNA-Seq), qPCR, שהכלים המערבי, פרוטאומיקס, מטבולומיקס.
בניסוי שלנו למשל, נדגים את הפרוטוקול באמצעות כריתה ותרבות של שומן הגוף של היתוש קדחת צהובה, Aedes aegypti, וקטור העיקרי של arboviruses כולל קדחת דנגה, chikungunya Zika. RNA מגופים שומן תרבותי תחת מצב פיזיולוגי ידוע upregulate חלבונים חלמון לעומת הפקד היו RNA-Seq ניתוח כדי להדגים את התועלת פוטנציאלי של הליך החקירות של ביטוי גנים.

לדוגמה, אנו ביצע ניסוי תרבות הגוף השמן, מגורה בודדים גופות שומן על ידי המקננת בהם על פתרון המכיל תערובת מאוזנת של כל עשרים חומצות אמינו המתרחשים באופן טבעי את החרקים הורמונים סטרואידים הידרוקסי 20 ecdysone (10 מיקרומטר) עבור 6-אייץ ' . כפקד, שומן הגוף היו מודגרות ב- APS עבור כמות שווה של הזמן.
לאחר דגירה, הרנ א סה כ היה מבודד באמצעות tri-ריאגנט27 ההוראות של היצרן. האיכות והכמות של דגימות RNA שחולצו היו העריכו באמצעות ספקטרופוטומטרים, כימות fluorometric, agarose בג'ל. ספריות רצפי RNA נוצרו באמצעות 4 µg של RNA הכולל, היו לכמת באמצעות שתי טכניקות שונות. לאחר מכן, הספריות נשלחו ספק מסחרי עבור סיום לזווג-רצף.
תוצאות ניסוי זה מוצגים טבלה 6. גנים מציג את החזקה תעתיק בתגובה חומצת אמינו ו- 20-hydroxyecdysone היו בעיקר חלמון חלבון גנים, אשר הוא מסכים עם תוצאות קודמות11.
איור 1 מציג מפת החום המציין את רמות ביטוי גנים בכ-1,256 באופן שונה לידי ביטוי גנים מגופים שומן בתרבית לאחר שני טיפולים שונים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55508/55508fig1.jpg"> 
איור 1 . חום מפה של גנים ביטוי בתרבות הגוף השמן. המפה החום היה מחושב בהתבסס על מספר תעתיקים ספציפיים עבור כל ג'ין בספריות שונות באמצעות חבילת heatmap28 המהווה חלק הסביבה תוכנה R. הגוון כהה מייצג ביטוי גנים גבוה יותר. גנים 1,256 עם וריאציה סטטיסטית בביטוי (Q-ערכים &#60; 0.05) מוצגים. הגנים מסודרים לפי רמות ביטוי בממוצע שלהם, שמציין את dendrogram בצד השמאל (לא לפי יחסיהם פילוגנטי). הערה המספר הגבוה של גנים עם מעלה או למטה-מוסדר ביטוי לאחר גירוי עם חומצות אמינו (AA) ו 20-hydroxyecdysone (20E). APS = תמיסת מלח פיזיולוגית אאדס . ראה 1 קובץ משלים עבור רשימת גנים ואת רמות ביטוי היחסי שלהם. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/55508fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>חומצת אמינו</td>
			<td>מולקולרית משקל גר'/מול</td>
			<td>מ מ ריכוז</td>
			<td>מ ג לליטר</td>
			<td>מ"ג עבור אמצעי האחסון 300 מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אלנין</td>
			<td>המהווה 89.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>2377.19</td>
			<td>713.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ארגינין</td>
			<td>174.2</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4647.66</td>
			<td>1394.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אספרגין</td>
			<td>150.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4004.67</td>
			<td>1201.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>חומצה אספרטית</td>
			<td>133</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3548.44</td>
			<td>1064.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ציסטאין</td>
			<td>121.16</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1293.99</td>
			<td>388.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>חומצה גלוטמית</td>
			<td>147.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3924.63</td>
			<td>1177.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>גלוטמין</td>
			<td>146</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3895.28</td>
			<td>1168.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>גליצין</td>
			<td>75</td>
			<td>53.32</td>
			<td>3999</td>
			<td>1199.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>היסטידין</td>
			<td>155.16</td>
			<td>80</td>
			<td>12412.8</td>
			<td>3723.84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>איזולאוצין</td>
			<td>131</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1399.08</td>
			<td>419.72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycine</td>
			<td>183</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4882.44</td>
			<td>1464.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>לאוצין</td>
			<td>131</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3495.08</td>
			<td>1048.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פנילאלנין</td>
			<td>165</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1762.2</td>
			<td>528.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פרולין</td>
			<td>115</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3068.2</td>
			<td>920.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סרין</td>
			<td>105</td>
			<td>53.32</td>
			<td>5598.6</td>
			<td>1679.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תראונין</td>
			<td>119</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1270.92</td>
			<td>381.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>טריפטופן</td>
			<td>204</td>
			<td>10.68</td>
			<td>2178.72</td>
			<td>653.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>טירוזין</td>
			<td>181</td>
			<td>5.32</td>
			<td>962.92</td>
			<td>288.88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ולין</td>
			<td>117</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1249.56</td>
			<td>374.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מתיונין</td>
			<td>149</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1591.32</td>
			<td>477.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1. 4 X פתרון מלאי חומצה אמינית.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>רכיב</td>
			<td>משקל בגרמים נוספו 50 מ ל ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>8.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>0.074 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6 H2O</td>
			<td>0.120 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>0.0250 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
בטבלה 2. 20 X מלח פתרון מניות.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>רכיב</td>
			<td>משקל בגרמים נוספו ddH2O 100 מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2-2 H2O</td>
			<td>0.90 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<stron></stron>g > בטבלה 3. 50 X מניות תמיסת סידן.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>רכיב</td>
			<td>ריכוז של פתרון מניות</td>
			<td>אמצעי אחסון מלאי עבור מאגר 100 מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>טריס pH8.0</td>
			<td>1 מ'</td>
			<td>5 מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.25 M</td>
			<td>2 מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>נה</td>
			<td>0.3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>נה</td>
			<td>100 מ ל (~ 93 מ"ל)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
בטבלה 4. מאגר טריס.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>רכיב</td>
			<td>אמצעי אחסון מלאי עבור 200 מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פתרון מניות חומצת אמינו</td>
			<td>150 מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מניות תמיסת מלח</td>
			<td>10 מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תמיסת סידן מניות</td>
			<td>4 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מלון טס מאגר</td>
			<td>10 מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>מ ל 26</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 5- תרבות הגוף השמן בינונית.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ביאור</td>
			<td>תיאור הגן</td>
			<td>מקפלים שינוי</td>
			<td>ערך-P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006138</td>
			<td>Vitellogenin-B</td>
			<td>3443</td>
			<td>2.52E-112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006126</td>
			<td>Vitellogenin-C</td>
			<td>2795</td>
			<td>8.64E-91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006563</td>
			<td>קרבוקסיפפטידאז vitellogenic</td>
			<td>1002</td>
			<td>2.17E-119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010434</td>
			<td>Vitellogenin-A</td>
			<td>220</td>
			<td>1.14E-27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006542</td>
			<td>קרבוקסיפפטידאז vitellogenic</td>
			<td>185</td>
			<td>2.14E-65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL012678</td>
			<td>AAEL003006-פה [אאדס aegypti](65%)</td>
			<td>96</td>
			<td>4.00E-70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL000080</td>
			<td>חלבון היפותטי</td>
			<td>82</td>
			<td>6.69E-188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL015312</td>
			<td>Vitellogenic cathepsin B</td>
			<td>77</td>
			<td>1.27E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL009588</td>
			<td>קולטן גרעיני 3</td>
			<td>75</td>
			<td>4.58E-56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010529</td>
			<td>חלבון היפותטי</td>
			<td>66</td>
			<td>1.32E-29</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 6- תוצאות ניסויית.
משלימה קובץ 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/Table_of_genes_for_figure_1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus at JoVE.com

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

שומן הגוף הוא האיבר מטבולית במרכז בחרקים. אנו מציגים מערכת תרבות איברים חיים המאפשרת למשתמש ללמוד את התגובות של רקמות הגוף השמן מבודד לגירויים שונים.

תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

fat-body-organ-culture-system-in-aedes-aegypti-a-vector-of-zika-virus

Research

JoVE Journal

Biology

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

9.4K Views.  New Mexico State University. שומן הגוף הוא האיבר מטבולית במרכז בחרקים. אנו מציגים מערכת תרבות איברים חיים המאפשרת למשתמש ללמוד את התגובות של רקמות הגוף השמן מבודד לגירויים שונים.

Video: Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Immunology and Infection

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

פרוטוקול זיהומים דנגי ב יתושים (א aegypti) ו הפנוטיפ קביעת זיהום

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

התפשטות הטפיל המיקרו-ספורידיאן אדהאזרדיה אדיס ב-Aedes aegypti יתושים

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

האכלה וכימות של דם שמקורו בבעלי חיים וארוחות מלאכותיות יתושים Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

שמירה על Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

מבחני פוריות ופוריות משופרים עבור Aedes aegypti באמצעות 24 צלחות תרבית רקמה באר (צלחות EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...