פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, במיוחד מיקרוסקופיית שחזור אופטי סטוכסטי ישיר, הידועה גם בשם dSTORM, כדי לעקוף את מגבלת עקיפה ולהמחיש את השטחים EVs בדיוק ננומטר בשלושה ממדים. אחד היתרונות הבולטים של dSTORM הוא יכולתה לדמיין חלקיקים ישירות מתחת לרמת עקיפה של אור מבלי לפגוע בצעדים המשנים את האופי הביוכימי של ה- EV. וירוסים רבים מבחינה אבולוציונית מועסקים איתות EV, ולכן, dSTORM יכול לשמש כדי לאפיין את EVs עבור סמנים ביולוגיים של מחלות והתקדמות, כמו גם לדמיין חלקיקי וירוס בודדים, כגון SARS-CoV2. התחל על ידי הצבת שלפוחיות מטוהרות, חוץ-תאיות, או כלי עבודה אלקטרוניים, על תחתית זכוכית, מפולת מיקרו, שמונה צלחות באר בנפח כולל של 200 מיקרוליטרים, ולאפשר להם לדבוק על פני השטח בן לילה בארבע מעלות צלזיוס.
מבלי להסיר את הפתרון הקיים מלוח שמונה הבארות, תקן את ה- EVs על הלוחות על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של 4% paraformaldehyde ב- 1X PBS לפתרון המכיל EV בכל באר ואפשר ללוחות לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות paraformaldehyde ופתרון עודף עם micropipette לא להפריע את EVs. לשטוף את EV עם 1X PBS כדי להסיר paraformaldehyde עודף.
בצע את הליך הכביסה שלוש פעמים. הסר עודף 1X PBS. הכן 250 מיקרוליטרים של פתרון חיץ dSTORM Bcubed לכל מדגם על-ידי יצירת פתרון של דיוקסיגנאז פרוטוקטכוי של חמישה מילימטרים מדולל במאגר הדמיה לפי פרוטוקול היצרן.
הוסיפו 250 מיקרוליטרים של המאגר המוכן לכל באר, לפי פרוטוקול היצרן, ודגרו את הלוחות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני ההדמיה כדי לחפש מולקולות מחמצנות. ניתן לדמיין את ה- EVs באופן מיידי או לאחסן בארבע מעלות צלזיוס במשך שבוע. כדי להכין את החרוזים הנדרשים לכיול המיקרוסקופ ברזולוציית העל, לדלל מיקרוספרות של 100 ננומטר לריכוז של 0.5% במים מולקולריים של ביולוגיה ביולוגית, ופיפטה 200 מיקרוליטרים לכל באר של צלחת בתחתית זכוכית, מיקרו-מגלשה ושמונה בארות.
אפשר לחרוזים להתיישב בבארות במשך שעה בטמפרטורת החדר. מבלי להסיר את הפתרון הקיים, הוסף 200 מיקרוליטרים של 4% paraformaldehyde ב- PBS לכל באר לפתרון חרוז הכיול, ולאפשר דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את paraformaldehyde עם micropipette לא להפריע החרוזים, ולשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 1X PBS.
הכן את המאגר כמתואר בכתב היד. הסר PBS 1X והוסף 250 מיקרוליטרים של המאגר המוכן לכל באר. אפשר למאגר לשבת במשך 20 דקות לפני הפריט החזותי.
השתמש בלחצן חבר את המיקרוסקופ כדי להתחבר למיקרוסקופ תלת-ממדי לפני הנחת משהו על הבמה. הוסף שמן פי 100 למטרה, והצב את מרכז הבאר על גבי המטרה. בהגדרה רכישה, הפעל את לייזרי העירור של 473 ו- 640 ננומטר ולחץ על View.
מבלי להפעיל את עדשת תלת-ממד, הצג את החרוזים תחת ההגדרה רוויית פוטון על-ידי לחיצה על ספירות פוטון באפשרויות תצוגת תמונה. הגדר את כוחות הלייזר הראשוניים ל-8.4 מילי-וואט ללייזר 473 ננומטר, ו-11.6 מילי-וואט ללייזר 640 ננומטר. להקטין את המוקד של הלייזר סביב מינוס 300 ננומטר או את המישור המוקד של חרוזי הכיול כדי לייצר רזולוציה ברורה של החרוזים בודדים.
לאחר שמטוס Z ממוקד, התאם עוד יותר את רמות כוח הלייזר כדי להסביר את השונות בכל שדה ראייה. תחת פונקציות המכשיר, הכיול המיפוי 3D וכיול מיפוי הערוצים כדי לקבל את השגיאות בציר X, Y ו- Z. הגדר את המספר המרבי של שדות תצוגה ל- 20, את מספר הנקודות המשמש כ- 4, 000, את המרחק המרבי בין ערוצים ל- 5.0 פיקסלים ואת רדיוס האי-הכללה בין ערוצים ל- 10.0 פיקסלים במהלך כיול מיפוי הערוצים.
ודא שהכיול מייצר כיסוי נקודתי של יותר מ- 90% ואיכות מיפוי טובה. שמור את נתוני הכיול הנתונים עבור רכישות עתידיות של תמונות. הוסף שמן פי 100 על המטרה, והנח את ה- EVs המוכנים על המיקרוסקופ.
מבלי להפעיל את העדשה התלת-ממדית, הפעל את לייזר העירור 640 ננומטר, ובתחילה להעלות אותו בין 1.2 ל 12.5 מילי וואט, בהתאם לעוצמת האות בשדה הראייה כדי לרגש את הממברנה האדומה, intercalating, צבעוני מוכתם EVs. תחת אפשרויות תצוגת תמונה, עברו את שיטת הצפייה מרווי פוטון לאוזלונים כדי להציג את השטחים החלוציים באופן טוב יותר. התאם את עוצמת הלייזר כדי למזער רעש תוך מיקסום האות ולשמור על כל הפרמטרים האחרים.
התאם את המוקד של מישור Z על-ידי לחיצה על סמל למעלה או למטה בציר Z. הגדר את זמן החשיפה ל- 20 אלפיות השניה, את לכידת המסגרת ל- 10, 000 פריימים ואת עוצמת הלייזר ההתחלתית ל- 1.2 עד 12.5 מילי-וואט, בהתאם לעוצמת האות ושדה הראייה. הפעל את עדשת 3D באמצעות הסמל, ולהתחיל את הרכישה על ידי לחיצה על כפתור רכישה.
לאורך כל תהליך רכישת התמונה, העלה את עוצמת הלייזר בשלושה במרווחים של 10 כל 1000 פריימים, או מספיק כדי לשמור על יחס אות לרעש גבוה. אל תתאים את מטוס Z במהלך הרכישה. לאחר רכישת התמונה, עבור לחלון הצפייה 'ניתוח'.
בצע תיקון סחף בתמונה הלא מסוננת ולאחר מכן הפעל מסננים. התאם את ספירת הפופוטים, דיוק לוקליזציה, סיגמות ומדד המסגרות, כפי שצוין בכתב היד. שכבת-על כלי תצוגה X, Y, Z-plane לאורך ציר X של כלי עבודה חשמליים בודדים משדה הראייה וייצוא קבצי csv בודדים של אירועי צילום.
חוצה כלי עבודה חשמליים בודדים על ציר X, ציר Y בשדה X על ידי Y באמצעות כלי היסטוגרמה של קו, המצמיד אירועים של תמונות לקבוצות מרחק מוגדרות. צמו תמונות של קורות עבודה אלקטרוניים בודדים ושמרו אותם כקבצי tif. צרו סרטוני תלת-ממד של כלי עבודה אלקטרוניים בודדים באמצעות כלי תצוגה חזותי תלת-ממדי וצבע בהתאם למיקום לאורך ציר Z.
בעקבות הכיול של המיקרוסקופ שיצר שגיאה ממוצעת של 16 ננומטר על X, ציר Y ו 38 ננומטר על ציר Z, eVs u20s מטוהרים הוצגו בהצלחה עם רזולוציה של עד 20 ננומטר על X, ציר Y, ו 50 ננומטר לאורך ציר Z. כלי הפעלה חשמליים בודדים שדמיינו באמצעות dSTORM בתמונות תלת-ממדיות לאורך החשיפה למסגרת 10,000 עם התגברות כוח הלייזר, והיו גלויים לעין בתמונה שנרכשה. תיקון תמונה לאחר הרכישה במישור Z, ספירת פוטון, סיגמות ודיוק לוקליזציה של התמונה המשוחזרת הביא לרזולוציה ברורה של EV בתלת-ממד.
EV photoswitched רק 7, 000 פריימים הראשונים, כפי שניתן לראות על ידי האגדה בפינה הימנית העליונה. היסטוגרמה מאשרת כי רוב אירועי ההטלה התרחשו ברדיוס של 100 ננומטר, מה שמאשר כי הרכב המדמיין הוא אקסוזום, וכי הבידוד של EVs בקוטר קטן הצליח. ניתוח התפלגות גודל שבוצע על כלי עבודה אלקטרוניים אחרים במעקב פרטני באמצעות הכלי היסטוגרמה קו וכלי X, Y, Z-plane View אישר כי רוב אירועי ה- photoswitching התרחשו ברדיוס של 100 ננומטר של המרכז.
השגיאה לאורך ציר Z הוגברה, והפיקה תמונה סופית מוארכת של EV לאורך הציר הצירי. אירועי פוטו-וויצ'ינג לא היו מתואמים עם גודל הרכב המוצלב, מה שמוכיח כי אפיון מבוסס dSTORM יכול לשמש עבור EVs קטנים כמו אקסוזומים ווירוסים קטנים, עטופים פחות מ -100 ננומטר קוטר. בעת ביצוע dSTORM חשוב לזכור להגדיר את כוח הלייזר הראשוני נמוך מאוד, ולאט לאט להעלות אותו לאורך רכישת תמונה על מנת למנוע הדממה.
מאז התפתחותו, dSTORM אפשר לחוקרים להבין טוב יותר את המורפולוגיה של מבנים תת-תאיים שבעבר לא ניתן היה לדמיין בשל מגבלת עקיפה של מיקרוסקופיית אור טיפוסית.
