Этот протокол использует микроскопию сверхвысокого разрешения, в частности прямую стохастическую оптическую реконструкционную микроскопию, также известную как dSTORM, для обхода дифракционного предела и визуализации электромобилей с нанометровой точностью в трех измерениях. Одним из заметных преимуществ dSTORM является его способность непосредственно визуализировать частицы ниже уровня дифракции света без повреждения шагов, которые изменяют биохимическую природу EV. Многие эволюционно различные вирусы используют сигнализацию EV, поэтому dSTORM может быть использован для характеристики EV для биомаркеров и прогрессирования заболевания, а также для визуализации отдельных вирусных частиц, таких как SARS-CoV2. Начните с размещения аффинно-очищенных внеклеточных везикул или EV на стеклянные, микроскользящие, восьмилуночные пластины общим объемом 200 микролитров и позвольте им прилипнуть к поверхности в течение ночи при четырех градусах Цельсия.
Не удаляя существующий раствор из восьмилуночной пластины, закрепите EV на пластинах, добавив 200 микролитров 4%-го параформальдегида в 1X PBS к EV-содержащему раствору в каждой скважине и дайте пластинам инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Осторожно удалите параформальдегид и избыток раствора с помощью микропипетки, чтобы не нарушить работу электромобилей. Вымойте EV с 1X PBS, чтобы удалить избыток параформальдегида.
Выполните процедуру умывания три раза. Удалите лишние 1X PBS. Готовят 250 микролитров буферного раствора dSTORM Bcubed на образец путем создания раствора пятимиллимолярной протокатехуической диоксигеназы, разбавленной в буфере визуализации в соответствии с протоколом производителя.
Добавьте 250 микролитров подготовленного буфера к каждой скважине в соответствии с протоколом производителя и инкубируйте пластины в течение 20 минут при комнатной температуре перед визуализацией для очистки окисляющих молекул. Электромобили могут быть визуализированы сразу или храниться при четырех градусах Цельсия в течение недели. Для подготовки шариков, необходимых для калибровки микроскопа сверхвысокого разрешения, разбавляют 100-нанометровые микросферы до концентрации 0,5% в воде класса молекулярной биологии и пипетку по 200 микролитров в каждую скважину стеклянного дна, микроскольжения, восьмилуночной пластины.
Дайте шарикам осесть в колодцах в течение одного часа при комнатной температуре. Не удаляя имеющийся раствор, добавляют 200 микролитров 4%-ного параформальдегида в ПБС в каждую лунку к калибровочному шариковому раствору, и дают инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Осторожно удалите параформальдегид микропипеткой, чтобы не потревожить бусины, и трижды вымойте бусины 1X PBS.
Подготовьте буфер, как описано в рукописи. Удалите 1X PBS и добавьте 250 микролитров подготовленного буфера в каждую лунку. Дайте буферу посидеть в течение 20 минут перед визуализацией.
Используйте кнопку Подключить микроскоп для подключения к 3D-микроскопу перед размещением чего-либо на сцене. Добавьте 100X масла к цели и поместите центр скважины поверх цели. В настройке «Получить» включите 473- и 640-нанометровые лазеры возбуждения и нажмите «Вид».
Не активируя 3D-объектив, просмотрите бусины под настройкой насыщенности фотонов, щелкнув Счетчики фотонов в параметрах отображения изображения. Установите начальную мощность лазера на 8,4 милливатта для 473-нанометрового лазера и 11,6 милливатт для 640-нанометрового лазера. Уменьшите фокус лазера примерно до минус 300 нанометров или фокальной плоскости калибровочных шариков, чтобы получить четкое разрешение отдельных шариков.
После того, как Z-плоскость сфокусирована, дополнительно отрегулируйте уровни мощности лазера, чтобы учесть изменения в каждом поле зрения. В соответствии с функциями прибора выполните калибровку 3D-отображения и калибровку отображения каналов для получения ошибок на оси X, Y и Z. установите максимальное число полей зрения равным 20, целевое число точек — 4 000, максимальное расстояние между каналами — 5,0 пикселя, а радиус исключения между каналами — 10,0 пикселя во время калибровки сопоставления каналов.
Убедитесь, что калибровка обеспечивает охват точек более 90% и хорошее качество отображения. Сохраните данные калибровки для будущих сборов изображений. Добавьте 100X масла на объектив и поместите подготовленные электромобили на микроскоп.
Не активируя 3D-линзу, включите 640-нанометровый лазер возбуждения и первоначально поднимите его до 1,2-12,5 милливатт, в зависимости от интенсивности сигнала в поле зрения, чтобы возбудить красную мембрану, интеркалирующие, окрашенные красителем ev. В разделе Параметры отображения изображения переключите метод просмотра с насыщенности фотонов на процентили, чтобы лучше визуализировать электромобили. Отрегулируйте мощность лазера, чтобы свести к минимуму шум, максимизируя сигнал и сохраняя все остальные параметры.
Отрегулируйте фокус плоскости Z, щелкнув значок вверх или вниз по оси Z. Установите время экспозиции на 20 миллисекунд, захват кадра на 10 000 кадров и начальную мощность лазера на расстоянии от 1,2 до 12,5 милливатт в зависимости от интенсивности сигнала и поля зрения. Активируйте 3D-объектив с помощью значка и начните съемку, нажав на кнопку «Получить».
На протяжении всего процесса получения изображения повышайте мощность лазера на три шага по 10 каждые 1000 кадров или достаточно для поддержания высокого отношения сигнал/шум. Не регулируйте Z-плоскость во время захвата. После получения изображения переключитесь в окно просмотра Анализ.
Выполните коррекцию дрейфа на нефильтрованном изображении, а затем активируйте фильтры. Отрегулируйте количество фотонов, точность локализации, сигмы и индекс кадра, как указано в рукописи. Наложите инструмент просмотра плоскости X, Y, Z вдоль оси X отдельных электромобилей из поля зрения и экспортируйте отдельные CSV-файлы событий переключения фотографий.
Разделите пополам отдельные электромобили по оси X, Y в поле зрения X by Y с помощью инструмента «Гистограмма линии», который закрепляет события переключения фотографий в заданные группы расстояний. Делайте снимки отдельных электромобилей и сохраняйте их в виде файлов tif. Создавайте 3D-видео отдельных электромобилей с помощью инструмента 3D-визуализации и раскрашивайте их в соответствии с размещением вдоль оси Z.
После калибровки микроскопа, которая дала среднюю погрешность 16 нанометров на оси X, Y и 38 нанометров на оси Z, очищенные электромобили u20s были успешно визуализированы с разрешением до 20 нанометров по оси X, Y и 50 нанометров вдоль оси Z. Отдельные электромобили, визуализированные через dSTORM в 3D-фотографиях, переключались на протяжении 10 000 кадров по мере увеличения мощности лазера и были легко видны на полученном изображении. Коррекция изображения после получения в Z-плоскости, количество фотонов, сигмы и точность локализации реконструированного изображения привели к четкому разрешению EV в 3D.
Фотографии EV переключались только в течение первых 7000 кадров, как видно легенде в правом верхнем углу. Гистограмма подтверждает, что большинство событий фотопереключения произошло в радиусе 100 нанометров, подтверждая, что визуализированный EV является экзосомой, и что изоляция электромобилей небольшого диаметра была успешной. Анализ распределения размеров, выполненный на других индивидуально прослеженных электромобилях с использованием инструмента «Гистограмма линии» и инструмента «X, Y, Z-plane View», подтвердил, что большинство событий фотопереключения произошло в радиусе 100 нанометров от центра.
Погрешность вдоль оси Z была увеличена, что привело к удлиненному конечному изображению EV вдоль осевой оси. События переключения фотографий не коррелировали с размером EV, демонстрируя, что характеристика на основе dSTORM может использоваться для небольших электромобилей, таких как экзосомы и небольшие вирусы с оболочкой диаметром менее 100 нанометров. При выполнении dSTORM важно не забывать устанавливать начальную мощность лазера очень низко и медленно повышать ее на протяжении всего захвата изображения, чтобы предотвратить фотоотбеливание.
С момента своего развития dSTORM позволил исследователям лучше понять морфологию субклеточных структур, которые ранее было невозможно визуализировать из-за дифракционного предела типичной световой микроскопии.
