אחד האתגרים העיקריים בהנדסת רקמת לב אנושית כולל כלי הדם שלה. המעבדה שלנו פיתחה מודל במבחנה של הלב האנושי על ידי שיתוף culturing תאים נמצאו vivo. אלה כוללים מיוציטים לבביים, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל לבביים.
בסך הכל, תאים אלה מאפשרים את סיכום המיקרו-וירוס של הלב האנושי, כולל הרכיבים המולקולריים, התאיים והתאיים הנוספים שלו. אנחנו משתמשים בהם במעבדה שלנו כדי לבדוק תרופות שונות לחיבורים רעילים לסמים. אלה כוללים טוקסורוביצין, תרופה קרדיוטוקסית ידועה המשפיעה על הלבבות האנושיים גם שנים לאחר הטיפול שלה.
אנו מתרבים פיברובלסטים לבביים, תאי אנדותל ומיוציטים בנפרד לפני יצירת כדוריות. על מנת לגדל קרדיומיוציטים, אנו אוספים את הבקבוקון ממינוס 80 מעלות ואנחנו מחממים אותו ב 37 מעלות במשך ארבע דקות באמבט מים. לאחר מכן אנו מרססים את בקבוקון ההקפאה עם 70% אתנול ומעבירים אותו לארון בטיחות ביולוגי.
אנחנו אוספים בעדינות את ההשעיה של התא ומעבירים אותו לצינור פלקון 15 מיליליטר. אנחנו אוספים מיליליטר אחד של ציפוי טרום המלחמה בינוני, לשטוף את בקבוקון ההקפאה פעם אחת ולאחר מכן להוסיף אותו צינור פלקון 50 מיליליטר, טיפה אחת בכל פעם כל ארבע שניות. תוך כדי הוספת מדיום ציפוי, בעדינות לנער את צינור פלקון.
עם פיפטה תא, לאסוף שבעה מיליליטר של ציפוי בינוני בעדינות להוסיף אותו צינור פלקון 15 מיליליטר. לאחר שהוסיף את הנפח הסופי של ציפוי בינוני לצינור פלקון, להעביר את ההשעיה התא לבקבוקי רקמה מקודד fibronectin. לבסוף, להעביר תאים לאנקובטור.
לאחר יומיים, אנו אוספים את צלפי הרקמה מהחממה ואנחנו בודקים את התכנסות התאים מתחת למיקרוסקופ. בשלב זה, אנו מעבירים את הבקבוק לארון ביו בטיחות ואנחנו מסירים את מדיום ציפוי. אנחנו שוטפים בעדינות תאים עם אותו מדיום ציפוי מבקבוק הרקמה ארבע או חמש פעמים.
אנחנו מחליפים אותו במדיום תחזוקה טרי ומעבירים אותם לחממה למשך יום עד יומיים נוספים. ביום שבו אנו יוצרים תליות של תרבויות, אנו אוספים את כל שלושת סוגי התאים מהחרם. אנחנו שבב בתאים על ידי הסרת התקשורת.
אנחנו שוטפים אותם עם שלושה מיליליטר של PBS. ולבסוף אנחנו מוסיפים את השבבים לתאים. לאחר מכן מועברים הבקבוקים לאנקובטור, ומוגדלים עד חמש דקות.
על מנת ליצור כדורי לב, אנחנו במשותף תרבות 20, 000 תאים לכל טיפה תלויה. אלה כוללים 10, 000 קרדיומיוציטים, אלף פיברובלסטים לב ו 5, 000 תאים פנימיים לב. אלה מתורבתים במשותף בירידה תלויה 384 צלחות באר.
הם מצופים באמצעות מערכת הטיפול בנוזלים שלנו. אנחנו גם מוסיפים PBS על קירות הצד של צלחות טיפה תלויות כדי למנוע את התרבויות להתייבש באינקובטור. בזהירות להעביר את צלחת טיפה תלויה המכיל תאים לאנקובטור.
בין שלושה לארבעה ימים, ספרואיד ייוופס. אנחנו אוספים את צלחת הירידה התלויה מהחמה ואנחנו בודקים שספירואידים נוצרים בתוך כל באר. כפי שמוצג בתמונות אלה, יש לנו קבוצה של כדוריות בתוך המרכז של כל באר.
לאחר שנוצר, אנו אוספים כדוריות ומטביעים אותם בג'ל קולגן. קצה פיפטה נחתך מבפנים כדי למנוע נזק כדורי. כדורידים נאספים ומועברים לצינור פלקון 50 מיליליטר שבו הם נמשכים יחד.
אנחנו מסובבים את ההשעיה הספרואידית ב-300 ג'י לחמש דקות כדי להפריד אותם מהמדיום. אנו משתמשים כהה מוקף 96 צלחות גם כדי תמונה spheroids, התקשורת מוסרת או הוחלף עם ג'ל קולגן בצינור פלקון. נתרן הידרוקסידי מתווסף מתלי ג'ל כדורית לפני שהם מצופים בצלחת הקיר הכהה.
100 מיקרוליטר של השעיה כדורית מתווסף לתוך כל באר ודגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות. סמים, כולל טוקסורוביצין וסוכנים אחרים מתווספים לצלחת הכדוריד ודגירה במשך 24 שעות. למחרת, הכנו פתרון המכיל סידן AM ואתידיום הומודימר, תיוג לחיות מתחת לתאים בהתאמה.
פתרון זה מוכן בהוספת אגורה לצלחת מסנן זו. לאחר מכן, כדורי עופרת דגירה ב-37 מעלות למשך שעה. אנו משתמשים בקורא צלחות כדי למדוד את הפלואורסצנטיות של סידן AM ואת האתידידימר שלהם בצלחת.
מדידות אלה משמשות את התוכנה שלנו לביצוע ניתוח סטטיסטי. אנו מודדים את הפעילות החוזית של כדוריות שטופלו בתרופות השונות באמצעות מערכת יון אופטית. כדורידים מועברים לשלב שבין שתי אלקטרודות.
אלה מאפשרים גם לשלוט וגם למדוד את הפעילות החוזית לפי פוטנציאל שדה. בדרך זו, אנו יכולים לבדוק מתחים שונים וטווחי תדרים כדי לעורר כדוריות. ספרואיד בזמנו הוא בתמונה, והוא משמש למדידות אלה.
כדורידים שלא קיבלו טוקסורוביצין יוכלו לבנות בעקבות הגירוי החשמלי. להיפך, טוקסורוביצין שטופלו כדוריות לא יתכווץ. כדי לדמיין את צורת רשת התאים ה אנדותל בתוך כל ספרואיד, תיקנו אותם עם פתרון 4%paraformaldehyde במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
העברנו את הצלחת לשייקר שמאפשר חלחלה עדינה של הפתרון דרך הג'ל. PFA מוסר ו שטף שלוש פעמים עם פתרון PBS המכיל 0.01% תחמוצת נתרן. הבאנו התגייסות כמובן על ידי הוספת פתרון 0.02% של טריטון X ב PVSA במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
פתרון החסימה מכיל 3%BSA ב- PBC, אשר לאחר מכן מתווסף לצלחת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. פתרון המכיל את הנוגדן העיקרי נגד CD 31. סמן אנדותל מתווסף לצלחת כי הוא דגירה לאחר מכן לילה בארבע מעלות.
למחרת, פתרון הנוגדנים העיקרי מוסר והצלחת שטף שלוש פעמים עם פתרון PBS המכיל 0.01% תחמוצת נתרן. פתרון הנוגדנים המשני המכיל גם את כתם ההקס מתווסף לצלחת שאז דגירה בן לילה בארבע מעלות. לבסוף, פתרון הנוגדנים השני מוסר והצלחת שטף שלוש פעמים עם פתרון PBS המכיל 0.01% תחמוצת נתרן.
לאחר שהייה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים, ניתן לדמיין את הצלחת באמצעות מיקרוסקופ הקונפוקל שלנו. רשת כלי דם נכונה היא קריטית להישרדות ותפקוד תאי הלב. כדורי לב מציגים רשת תאים אנדותל כי טוב יותר recapitulates אחד נוכח בלב האנושי לעומת תרבויות monolayer של תאי לב.
בהתחשב בתכונות הייחודיות, כדורי לב מייצגים כלים מתקדמים לבדיקות במבחנה לחקר הלב וכלי הדם.
