המטרה הכוללת של הליך זה היא לפברק הידרוג'לים מיקרו-דפוס עבור מחקרים מיקרוסקופיה כוח המתיחה 2D. זה מושג על ידי ביצוע תחילה מכת קרילציית כיסוי זכוכית ויצירת השכבה הראשונה של הידרוג'ל polyacrylamide על זה. השלב השני הוא ליצור שכבת הידרוג'ל נוספת המכילה חרוזי פלואורסצנטיים למיקרוסקופיה של כוח המתיחה.
ההידרוג'ל הוא סנדוויץ 'עם כיסוי מיקרו דפוס להחליק על גבי זה, וכתוצאה מכך העברת חלבוני מטריצת מיקרו דפוס על פני השטח הידרוג'ל. לאחר מכן, הידרוג'ל polyacrylamide נשאר פילמור בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. החלק העליון של הכיסוי מוסר בזהירות.
הדמיית מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת כדי להראות את נוכחות החרוזים ואת ההעברה המוצלחת של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים בדוגמת מיקרו. שיטה זו מסייעת למדוד ביעילות ובדייקות מספר כוחות אחיזה באמצעות האור ושחרור התאים. מה שמאפשר להשיג מספר גבוה יותר של תצפית ניסיונית מאותה דגימה.
אז מדגים את ההליך יהיה ג'ואל כריסטיאן, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. מוסיפים 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים לתוך. לאחר מכן, להוסיף 18.75 מיליליטר של חומצה אצטית, 18.75 מיליליטר של 3-פרופיל מתקרילט ו 252.5 מיליליטר של אתנול לפתרון.
כאשר הפתרון הושלם, להעביר אותו לצלחת מתגבשת. קח 24 מילימטר כיסוי עגול מחליק, לנקות אותם עם ניגוב מדויק, ולשים אותם לתוך מתלה טפלון מותאם אישית. ואז לטבול אותו לתוך הפתרון ודגורה במשך 15 דקות.
קח את המדף ולשטוף אותו עם אתנול. ייבשו את כיסוי החלקות מתחת לזרימת האוויר. ניתן לאחסן פתקי כיסוי עם מקרילאט עד חודש בטמפרטורת החדר.
קח כיסוי עגול 15 מ"מ והניח אותו על צלחת פטרי. השתמש בעט יהלום כדי לסמן את הצד העליון של פתק הכיסוי. לאחר מכן להמשיך לנקות באמצעות טיפול פלזמה חמצן.
כיסוי החלק נקי ב 0.4 מיליבר ו 200 וואט במשך שתי דקות. פיפט 100 מיקרוליטרים של 0.01% של פתרון פולי-L-ליסין על פני השטח של החלקת הכיסוי ודגורה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את כיסוי להחליק עם 10 מילימולר ב pH של 8.5.
מוציאים את הנוזל העודף, אבל שומרים על פני השטח רטובים. Pipette 100 מיקרוליטרים של 50 מיליגרם למיליליטר של mPEG-SVA בתמיסת pH 8.5 10 מ"מ על פני השטח של החלקת הכיסוי ודגרה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את כיסוי מחליק עם 10 מילימולר pH 8.5.
לאחר מכן להוסיף שני microliters של ג'ל PLPP ואחריו 40 microliters של אתנול על פני השטח. הטה בעדינות את צלחת הפטרי כדי להומוגניזציה של התמיסה. המתן חמש דקות עד שהפתרון יקוטב.
מניחים את כיסוי החלק בתוך צלחת פטרי חור תחתון 35 מ"מ. שים את צלחת הפטרי המכילה את הפתק הכיסוי על במת המיקרוסקופ. התאימו את המיקוד על פני הזכוכית.
טען ונעל את התבנית שצוירה מראש. התחל את דפוס על ידי מינון UV של 30 מיליג'אול למילימטר בריבוע. לאחר השלמת שלב התבנית, הוציאו את החלקת כיסוי התבנית ושטפו את המשטח ב-PBS.
לדגור על המדגם עם תערובת של 100 מיקרוליטר של 25 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין ו 25 מיקרוגרם למיליליטר פיברינוגן מצומד עם Alexa 488 מומס PBS במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. כדי להכין את מצע הידרוג'ל, להתחיל עם לשים את כיסוי methacrylated להחליק לתוך צלחת פטרי. כדי להתחיל, להכין פתרון AgA מחומצן טרי על ידי הוספת 9.55 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר.
לאחר מכן להוסיף 0.5 מיליליטר של AgA. לאחר מכן להוסיף 42 מיליגרם של נתרן meta pyruvate לפתרון. הגדר את הפתרון על שייקר במשך ארבע שעות.
לאחר מכן להכין את פתרון המלאי על ידי ערבוב אקרילאמיד, ביס-אקרילאמיד, ומים מזוקקים כפולים על פי טבלה 1. פתרון המלאי יכול להישמר עד שנה בארבע מעלות צלזיוס. הכן את פתרון העבודה לשכבה התחתונה על ידי ערבוב 99.3 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי עם 0.5 מיקרוליטרים של אמוניום אסולפט 1% ו 0.2 מיקרוליטרים של TEMED.
קח 10 מיקרוליטרים מהפתרון ופיפטה טיפה-חכם על תלוש הכיסוי methacrylated. מניחים בזהירות כיסוי עגול 15 מ"מ על הטיפה ולחכות 45 דקות עד שהוא פולימר. לאחר מכן, לנתק את החלק העליון כיסוי עם האזמל.
לאחר מכן הכינו את פתרון העבודה לשכבה העליונה על ידי ערבוב 93.3 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי עם HEA מחומצן מיקרוליטר אחד, חמישה חרוזים פלואורסצנטיים מיקרוליטרים, 0.5 מיקרוליטרים של אמוניום אסולפט 1% ו 0.2 מיקרוליטרים של TEMED. קח חמישה מיקרוליטרים מהפתרון ופיפטה זה טיפה-חכם על הידרוג'ל השכבה התחתונה. מניחים בזהירות פתק כיסוי מיקרו-תבנית על הטיפה.
חכה 45 דקות עד שזה פולימר. נתק בעדינות את פתק הכיסוי עם אזמל. ולהדביק את החלקה הכיסוי על החלק התחתון של צלחת שש בארות קדח מותאם אישית.
הוסף PBS לבארות. כדי לראות את התאים, שאפו את ה-PBS מהצלחת בעלת ששת הבארות. עבור פיברובלסטים, להוסיף DMEM גלוקוז גבוה המכיל L-גלוטמין ולהוסיף אותו עם 10%FPS ו 1%פניצילין וסטרפטומיצין.
לדגור את התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5%CO2. הפעל את הפחמן הדו חמצני ואת החימום לשלב המיקרוסקופיה. ואז להפעיל את המיקרוסקופ ומניחים את צלחת הבאר על הבמה.
הגדר את תבנית התאורה וסמן תאים מעניינים. להתמקד מחדש על פני השטח של הידרוג'ל. השג את התמונה של התאים בערוץ ברייטפילד.
כדי לצלם את התמונה של החרוזים במצב המעוות, עבור לערוץ. לאחר מכן לעבור לערוץ הלייזר ולהאיר את התא על פי התבנית במשך שלוש דקות. זה מתאים למנה של 6,000 מיליג'אול למילימטר בריבוע.
לאחר מכן, החלף את הערוץ ורכוש את התמונה של החרוזים במצב לא מעוצב. כדי לחשב את כוחות המתיחה, פתח את תמונות החרוזים הפלואורסצנטיות שכבר תיקנו את הסחף לרוחב. הניתוח המלא של כוחות המתיחה מפורט בכתב המצורף.
כדי לאמת את ההידבקות הסלקטיבית של תאים לאזורים בדוגמת מיקרו על פני השטח של ההידרוג'לים, דגימות צולמו עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית באמצעות חלבוני מטריצה מסומנים מראש ועם מיקרוסקופיה בהירה כדי לדמיין תאים. המאפיינים המכניים של הידרוג'לים polyacrylamide היו מגוונים על ידי ערבוב כמויות שונות של אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד. נוקשות ההידרוגל הוערכה בניסויי ננו-ינדנטציה על ידי מיקרוסקופיה של כוח אטומי.
מדידות כוח המתיחה בוצעו לאחר החלת תאורת קרן לייזר מרחבית, מבוקרת זמנית, אולטרה סגולה כדי להאיר באופן סלקטיבי אזורים בגודל מיקרון של הידרוג'ל polyacrylamide. כוחות המתיחה שוחזרו באמצעות FTTC סדיר עם פרמטר הסדרה שנבחר על ידי אימות צולב כללי. הגישה המודולרית של המודל שלנו המבוססת על מיקרוסקופיה של כוח משיכה בשילוב עם שחרור אור ושימוש בתאים מיקרו-תבניתיים היא רב-תכליתית וניתן לנצל אותה עוד יותר עם מיקרוסקופיה אחרת ומערך הדמיה כדי לשפר את הרזולוציה והרגישות שלה.
