Bu prosedürün genel amacı, 2D çekiş kuvveti mikroskopi çalışmaları için mikro desenli hidrojeller imal etmektir. Bu, önce methacrylated cam kapak kayması yaparak ve üzerinde bir poliakrilamid hidrojelinin ilk tabakasını oluşturarak gerçekleştirilir. İkinci adım, çekiş kuvveti mikroskopisi için floresan boncuklar içeren başka bir hidrojel tabaka oluşturmaktır.
Hidrojel, üzerine mikro desenli bir kapak kayması ile sandviç yapılır ve bu da mikro desenli matris proteinlerinin hidrojel yüzeyine aktarılmasına neden olur. Daha sonra, poliakrilamid hidrojel oda sıcaklığında 45 dakika polimerize etmek için bırakılır. Üst kapak kayması daha sonra dikkatlice çıkarılır.
Floresan mikroskopi görüntüleme, boncukların varlığını ve mikro desenli hücre dışı matris proteinlerinin başarılı transferini göstermek için kullanılır. Bu yöntem, hücrelerin ışığını ve salınımını kullanarak çeşitli çekiş kuvvetlerini verimli ve hassas bir şekilde ölçmeye yardımcı olur. Aynı örnekten daha fazla sayıda deneysel gözlem elde etmek mümkün.
Prosedürü gösteren joel Christian olacak, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi. Bir kabın içine 10 mililitre çift damıtılmış su ekleyin. Daha sonra çözeltiye 18,75 mililitre asetik asit, 18,75 mililitre 3 propil methakrilit ve 252,5 mililitre etanol ekleyin.
Çözelti tamamlandığında, kristalize bir tabağa aktarın. 24 milimetre yuvarlak kapak slipleri alın, hassas bir silme ile temizleyin ve özel yapılmış bir teflon rafa koyun. Daha sonra çözeltiye daldırın ve 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Rafı alın ve etanol ile durulayın. Kapak kaymalarını hava akımı altında kurutun. Methacrylated kapak kaymaları oda sıcaklığında bir aya kadar saklanabilir.
15 milimetrelik yuvarlak bir kapak kayması alın ve bir Petri kabına yerleştirin. Kapak fişinin üst tarafını işaretlemek için elmas bir kalem kullanın. Daha sonra oksijen plazması tedavisi ile temizliğe devam edin.
Kapak fişi iki dakika boyunca 0,4 milibar ve 200 Watt'ta temizdir. Kapak kaymasının yüzeyine Poli-L-Lizin çözeltisinin% 0.01'inin 100 mikrolitresini pipetleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kapak fişini 8,5 pH'da 10 milimolar ile yıkayın.
Fazla sıvıyı çıkar, ancak yüzeyi ıslak tutun. Pipet 10 milimolar pH 8.5 çözeltisinde mililitre başına 50 miligram pipet kapak kaymasının yüzeyine 100 miligram ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kapak kaymalarını 10 milimolar pH 8.5 ile durulayın.
Daha sonra yüzeye iki mikrolitre PLPP jel ve ardından 40 mikrolitre etanol ekleyin. Çözeltiyi homojenize etmek için Petri kabını hafifçe eğin. Çözeltinin polarize olmasını beş dakika bekleyin.
Kapak fişini 35 milimetrelik bir alt delik Petri kabının içine yerleştirin. Kapak fişini içeren Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Odağı camın yüzeyine ayarlayın.
Önceden çizilmiş deseni yükleyin ve kilitleyin. Milimetre kare başına 30 milijoule UV dozu ile desenleme başlayın. Desenleme adımını tamamladıktan sonra desen kapağı fişini çıkar ve yüzeyi PBS ile durulayın.
Numuneyi, oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS'de çözünmüş Alexa 488 ile eşleştirilmiş mililitre fibronektin başına 25 mikrogram ve mililitre fibrinojen başına 25 mikrogramlık 100 mikrolitre karışımı ile kuluçkaya yatırın. Hidrojel substratını hazırlamak için, methacrylated kapak fişini bir Petri kabına koymakla başlayın. Başlamak için, 15 mililitrelik Falcon tüpüne 9,55 mililitre çift damıtılmış su ekleyerek taze oksitlenmiş AgA çözeltisi hazırlayın.
Ardından 0,5 mililitre AgA ekleyin. Daha sonra çözeltiye 42 miligram sodyum meta piruvat ekleyin. Çözeltiyi çalkalayıcıda dört saat ayarlayın.
Daha sonra tablo 1'e göre akrilamid, bis-akrilamid ve çift damıtılmış suyu karıştırarak stok çözeltisini hazırlayın. Stok çözeltisi dört santigrat derecede bir yıla kadar saklanabilir. 99,3 mikrolitre stok çözeltisini 0,5 mikrolitre amonyum persülfat %1 ve 0,2 mikrolitre TEMED ile karıştırarak alt tabaka için çalışma solüsyonunu hazırlayın.
Çözeltiden 10 mikrolitre alın ve pipet damlası olarak methacrylated kapak kaymasına alın. Damlacık üzerine dikkatlice 15 milimetrelik yuvarlak bir kapak kayması yerleştirin ve polimerize olması için 45 dakika bekleyin. Ardından, üst kapak kaymasını neşterle ayırın.
Daha sonra 93,3 mikrolitre stok çözeltisini bir mikrolitre oksitlenmiş HEA, beş mikrolitre floresan boncuk, 0,5 mikrolitre amonyum persülffat% 1 ve 0,2 mikrolitre TEMED ile karıştırarak üst tabaka için çalışma solüsyonunu hazırlayın. Çözeltiden beş mikrolitre alın ve alt katman hidrojel üzerine damla açısından pipetleyin. Damlacık üzerine dikkatlice bir mikro desenli kapak kayması yerleştirin.
Polimerize olması için 45 dakika bekleyin. Kapak fişini neşterle yavaşça ayırın. Ve kapak fişini özel delinmiş altı kuyu plakasının altına yapıştırın.
Kuyulara PBS ekleyin. Hücreleri görmek için PBS'yi altı kuyu plakasından aspire edin. Fibroblastlar için, L-glutamin içeren yüksek glikoz DMEM ekleyin ve% 10 FPS ve% 1 penisilin ve streptomisidin ile destekleyin.
Hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve%5 CO2'de kuluçkaya yatırın. Mikroskopi aşaması için CO2'yi ve ısıtmayı açın. Ardından mikroskobu açın ve kuyu plakasını sahneye yerleştirin.
Aydınlatma desenini ayarlayın ve ilgi çekici hücreleri işaretleyin. Hidrojel yüzeyine yeniden odaklanın. Brightfield kanalındaki hücrelerin görüntüsünü alın.
Boncukların görüntüsünü deforme durumda çekmek için kanala geçin. Daha sonra lazer kanalına geçin ve hücreyi üç dakika boyunca desene göre aydınlatın. Bu, milimetre kare başına 6.000 milijoule'lik bir doza karşılık gelir.
Daha sonra, kanalı değiştirin ve boncukların görüntüsünü biçimlendirilmemiş durumda alın. Çekiş kuvvetlerini hesaplamak için, yanal sürüklenme için zaten düzeltilmiş floresan boncuk görüntülerini açın. Çekiş kuvvetlerinin tam analizi ekli komut dosyasında ayrıntılı olarak yer almaktadır.
Hücrelerin hidrojel yüzeyindeki mikro desenli bölgelere seçici yapışmasını doğrulamak için, örnekler önceden etiketlenmiş matris proteinleri kullanılarak floresan mikroskopi ve hücreleri görselleştirmek için brightfield mikroskopisi ile görüntülenmiştir. Poliakrilamid hidrojellerin mekanik özellikleri, farklı miktarlarda akrilamid ve bis-akrilamid karıştırılarak değişmektedir. Hidrojel sertliği atomik kuvvet mikroskopisi ile nanoindentasyon deneyleri ile değerlendirildi.
Poliakrilamid hidrojelin mikron büyüklüğündeki bölgelerini seçici olarak aydınlatmak için mekansal, temporally kontrollü, ultraviyole lazer ışını aydınlatması uygulandıktan sonra çekiş kuvveti ölçümleri yapıldı. Çekiş kuvvetleri, genelleştirilmiş çapraz doğrulama ile seçilen bir düzenlileştirme parametresi ile düzenli fttc kullanılarak yeniden inşa edilmiştir. Işık ve mikro desen hücrelerinin kullanımı ile birlikte çekim kuvveti mikroskopisine dayanan model modüler yaklaşımımız çok yönlüdür ve çözünürlüğünü ve hassasiyetini artırmak için diğer mikroskopi ve görüntüleme kurulumu ile daha fazla kullanılabilir.
