Общей целью этой процедуры является изготовление микроструктурных гидрогелей для 2D-исследований тракционной силовой микроскопии. Это достигается путем предварительного изготовления метакрилированного стеклянного покрытия и формирования первого слоя полиакриламидного гидрогеля на нем. Вторым шагом является создание еще одного слоя гидрогеля, содержащего флуоресцентные шарики для тракционной силовой микроскопии.
Гидрогель зажат с микроструктурным покрытием поверх него, что приводит к переносу микроструктурных матричных белков на поверхность гидрогеля. Далее полиакриламидный гидрогель оставляют полимеризоваться при комнатной температуре в течение 45 минут. Затем верхний скольжение крышки аккуратно удаляется.
Флуоресцентная микроскопическая визуализация используется, чтобы показать наличие шариков и успешную передачу микроструктурированных белков внеклеточного матрикса. Этот метод помогает эффективно и точно измерить несколько тяговых сил с помощью света и использовать высвобождение клеток. Что позволяет получить большее количество экспериментальных наблюдений из одного и того же образца.
Таким образом, продемонстрировать процедуру будет Джоэл Кристиан, аспирант из моей лаборатории. Добавьте в стакан 10 миллилитров двойной дистиллированной воды. После добавьте в раствор 18,75 миллилитра уксусной кислоты, 18,75 миллилитра 3-пропилметакрилата и 252,5 миллилитра этанола.
Когда раствор будет готов, переложите его в кристаллизующуюся посуду. Возьмите 24-миллиметровые круглые крышки, очистите их прецизионной салфеткой и поместите в изготовленную на заказ тефлоновую стойку. Затем погрузить его в раствор и инкубировать в течение 15 минут.
Возьмите стойку и промойте ее этанолом. Высушит крышка под воздушным потоком. Метакрилированные крышки могут храниться до одного месяца при комнатной температуре.
Возьмите 15-миллиметровый круглый чехол и установите его на чашку Петри. Используйте алмазную ручку, чтобы отметить верхнюю сторону крышки. Затем приступают к очистке с помощью кислородно-плазменной обработки.
Крышка проскальзывает при 0,4 миллибар и 200 Вт в течение двух минут. Пипетка 100 микролитров 0,01% раствора поли-L-лизина на поверхность крышки скользит и насиживается в течение 30 минут при комнатной температуре. После промыть крышку с 10-миллимоларом при рН 8,5.
Выньте лишнюю жидкость, но держите поверхность влажной. Пипетка 100 микролитров по 50 миллиграмм на миллилитр mPEG-SVA в 10-миллимолярном растворе рН 8,5 наносится на поверхность крышки и инкубируется в течение одного часа при комнатной температуре. После промойте крышку с 10-миллимолярным рН 8,5.
Затем добавьте на поверхность два микролитра геля PLPP, а затем 40 микролитров этанола. Осторожно наклоните чашку Петри, чтобы гомогенизировать раствор. Подождите пять минут, пока раствор поляризуется.
Поместите крышку внутрь 35-миллиметрового отверстия чашки Петри. Поставьте чашку Петри, содержащую крышку, на ступень микроскопа. Отрегулируйте фокусировку на поверхности стекла.
Загрузите и заблокируйте предварительно нарисованный узор. Начните структурирование с УФ-дозы 30 миллиджоулей на миллиметр в квадрате. После завершения этапа создания рисунка выньте скольжение крышки шаблона и промойте поверхность PBS.
Инкубируют образец со 100-микролитровой смесью 25 мкг на миллилитр фибронектина и 25 мкг на миллилитр фибриногена, конъюгированного с Alexa 488, растворенным в PBS в течение одного часа при комнатной температуре. Чтобы приготовить субстрат для гидрогелей, начните с помещения метакрилированной крышки в чашку Петри. Для начала приготовьте свежий окисленный раствор AgA, добавив 9,55 миллилитров двойной дистиллированной воды в 15-миллилитровую трубку Falcon.
Затем добавляют 0,5 миллилитра AgA. Затем добавьте в раствор 42 миллиграмма метапирувата натрия. Поставьте раствор на шейкер на четыре часа.
Затем готовят бульонный раствор, смешивая акриламид, бис-акриламид и двойную дистиллированную воду согласно таблице 1. Запасной раствор можно хранить до года при четырех градусах Цельсия. Готовят рабочий раствор для нижнего слоя, смешивая 99,3 микролитра стокового раствора с 0,5 микролитрами персульфата аммония 1% и 0,2 микролитра TEMED.
Возьмите 10 микролитров из раствора и пипетку по каплям на метакрилированную крышку. Осторожно поместите на каплю 15-миллиметровый круглый чехол и подождите 45 минут, пока она полимеризуется. Далее отсоедините верхнюю крышку скальпелем.
Затем готовят рабочий раствор для верхнего слоя, смешивая 93,3 микролитра исходного раствора с одним микролитром окисленного HEA, пятью микролитрами флуоресцентных шариков, 0,5 микролитра персульфата аммония 1% и 0,2 микролитра TEMED. Возьмите пять микролитров из раствора и пипеткой по капле на нижний слой гидрогеля. Аккуратно поместите на каплю крышку с микроструктурой.
Подождите 45 минут, пока он полимеризуется. Аккуратно отсоедините крышку скальпелем. И приклейте крышку на дно изготовленной на заказ шестилуночной пластины.
Добавьте PBS в скважины. Чтобы увидеть клетки, аспирируйте PBS из шестилуночной пластины. Для фибробластов добавьте высокий уровень глюкозы DMEM, содержащий L-глютамин, и дополните его 10% FPS и 1% пенициллином и стрептомицином.
Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. Включите CO2 и нагрев для этапа микроскопии. Затем включите микроскоп и поместите пластину лунки на сцену.
Настройте рисунок освещения и отметьте интересующие ячейки. Перефокусировка на поверхности гидрогеля. Получите изображение клеток в канале brightfield.
Чтобы сделать снимок бусин в деформированном состоянии, переключитесь на канал. Затем переключитесь на лазерный канал и осветите ячейку по рисунку в течение трех минут. Это соответствует дозе 6 000 миллиджоулей на миллиметр в квадрате.
После переключите канал и получите изображение бусин в недеформированном состоянии. Чтобы рассчитать тяговые силы, откройте флуоресцентные изображения шариков, которые уже скорректированы для бокового дрейфа. Полный анализ тяговых сил подробно описан в прилагаемом скрипте.
Чтобы проверить селективную адгезию клеток к микроструктурированным областям на поверхности гидрогелей, образцы были визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием предварительно меченых матричных белков и с помощью микроскопии яркого поля для визуализации клеток. Механические свойства полиакриламидных гидрогелей варьировались путем смешивания различных количеств акриламида и бис-акриламида. Жесткость гидрогеля оценивали с помощью экспериментов с наноиндентированием с помощью атомно-силовой микроскопии.
Измерения силы тяги проводились после применения пространственного, контролируемого во времени, ультрафиолетового лазерного излучения для селективного освещения микронных областей полиакриламидного гидрогеля. Тяговые силы были реконструированы с использованием регуляризированного FTTC с параметром регуляризации, выбранным обобщенной перекрестной валидацией. Наш модульный подход, основанный на микроскопии силы притяжения в сочетании со светом и использованием микроструктурных клеток, является универсальным и может быть дополнительно использован с другой микроскопией и настройкой визуализации для улучшения ее разрешения и чувствительности.
