L’objectif global de cette procédure est de fabriquer des hydrogels à micro-motifs pour des études de microscopie à force de traction 2D. Ceci est accompli en faisant d’abord glisser un couvercle en verre méthacrylé et en formant la première couche d’un hydrogel de polyacrylamide dessus. La deuxième étape consiste à créer une autre couche d’hydrogel contenant des billes fluorescentes pour la microscopie à force de traction.
L’hydrogel est pris en sandwich avec un glissement de couverture de micro-motif sur le dessus, ce qui entraîne le transfert des protéines de la matrice de micro-motif sur la surface de l’hydrogel. Ensuite, l’hydrogel de polyacrylamide est laissé à polymériser à température ambiante pendant 45 minutes. Le couvercle supérieur est ensuite soigneusement retiré.
L’imagerie par microscopie à fluorescence est utilisée pour montrer la présence des perles et le transfert réussi de protéines de matrice extracellulaire à micro-motifs. Cette méthode permet de mesurer efficacement et précisément plusieurs forces de traction en utilisant la lumière et en utilisant la libération de cellules. Permettant d’obtenir un plus grand nombre d’observations expérimentales à partir du même échantillon.
Joel Christian, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera donc la démonstration de la procédure. Ajouter 10 millilitres d’eau double distillée dans un bécher. Ensuite, ajouter 18,75 millilitres d’acide acétique, 18,75 millilitres de méthacrylate de 3-propyle et 252,5 millilitres d’éthanol à la solution.
Lorsque la solution est complète, transférez-la dans un plat cristallisant. Prenez des couvercles ronds de 24 millimètres, nettoyez-les avec une lingette de précision et mettez-les dans un support en téflon sur mesure. Ensuite, immergez-le dans la solution et incubé pendant 15 minutes.
Prenez la grille et rincez-la avec de l’éthanol. Séchez le couvercle qui glisse sous le flux d’air. Les bordereaux de couverture en méthacrylate peuvent être conservés jusqu’à un mois à température ambiante.
Prenez un couvercle rond de 15 millimètres et placez-le sur une boîte de Pétri. Utilisez un stylo diamanté pour marquer la face supérieure du couvercle. Ensuite, procédez au nettoyage via un traitement au plasma à l’oxygène.
Le couvercle est propre à 0,4 millibar et 200 Watts pendant deux minutes. Pipette 100 microlitres de 0,01% de solution de Poly-L-Lysine sur la surface du couvercle glisser et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez le couvercle avec 10 millimolaires à un pH de 8,5.
Retirez l’excès de liquide, mais gardez la surface humide. Pipette 100 microlitres de 50 milligrammes par millilitre de mPEG-SVA dans une solution de pH 8,5 de 10 millimolaires sur la surface du couvercle et incuber pendant une heure à température ambiante. Ensuite, rincez les feuilles de couverture avec un pH de 10 millimolaires de 8,5.
Ajoutez ensuite deux microlitres de gel PLPP suivis de 40 microlitres d’éthanol sur la surface. Inclinez doucement la boîte de Petri pour homogénéiser la solution. Attendez cinq minutes que la solution se polarise.
Placez le couvercle à l’intérieur d’une boîte de Petri à trou inférieur de 35 millimètres. Placez la boîte de Petri contenant le couvercle sur la scène du microscope. Ajustez la mise au point sur la surface du verre.
Chargez et verrouillez le motif pré-dessiné. Commencez le modelage par une dose UV de 30 millijoules par millimètre carré. Après avoir terminé l’étape de modelage, retirez le couvercle du motif et rincez la surface avec du PBS.
Incuber l’échantillon avec un mélange de 100 microlitres de 25 microgrammes par millilitre de fibronectine et de 25 microgrammes par millilitre de fibrinogène conjugué avec Alexa 488 dissous dans du PBS pendant une heure à température ambiante. Pour préparer le substrat des hydrogels, commencez par mettre le couvercle méthacrylé glisser dans une boîte de Pétri. Pour commencer, préparez une solution d’AgA fraîche oxydée en ajoutant 9,55 millilitres d’eau double distillée dans un tube Falcon de 15 millilitres.
Ajoutez ensuite 0,5 millilitre d’AgA. Ajoutez ensuite 42 milligrammes de méta pyruvate de sodium à la solution. Réglez la solution sur le shaker pendant quatre heures.
Préparez ensuite la solution mère en mélangeant de l’acrylamide, du bis-acrylamide et de l’eau distillée en double conformément au tableau 1. La solution mère peut être conservée jusqu’à un an à quatre degrés Celsius. Préparer la solution de travail pour la couche inférieure en mélangeant 99,3 microlitres de solution mère avec 0,5 microlitre de persulfate d’ammonium 1% et 0,2 microlitres de TEMED.
Prélever 10 microlitres de la solution et pipette par goutte sur le couvercle méthacrylé. Placez soigneusement un couvercle rond de 15 millimètres sur la gouttelette et attendez 45 minutes pour qu’elle polymérise. Ensuite, détachez le couvercle supérieur avec le scalpel.
Ensuite, préparez la solution de travail pour la couche supérieure en mélangeant 93,3 microlitres de solution mère avec un microlitre de HEA oxydé, cinq billes fluorescentes de microlitres, 0,5 microlitre de persulfate d’ammonium 1% et 0,2 microlitres de TEMED. Prenez cinq microlitres de la solution et pipetez-la goutte sur l’hydrogel de la couche inférieure. Placez soigneusement un couvercle micro-motif sur la gouttelette.
Attendez 45 minutes pour qu’il polymérise. Détachez délicatement le couvercle avec un scalpel. Et collez le couvercle sur le fond d’une plaque de six puits percée sur mesure.
Ajoutez PBS aux puits. Pour voir les cellules, aspirez le PBS de la plaque à six puits. Pour les fibroblastes, ajoutez du DMEM riche en glucose contenant de la L-glutamine et complétez-le avec 10% FPS et 1% de pénicilline et de streptomycine.
Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de CO2. Allumez le CO2 et le chauffage pour l’étape de microscopie. Ensuite, allumez le microscope et placez la plaque de puits sur la scène.
Configurez le motif d’éclairage et marquez les cellules d’intérêt. Recentrez-vous sur la surface de l’hydrogel. Acquérir l’image des cellules dans le canal de champ lumineux.
Pour prendre l’image des perles à l’état déformé, passez au canal. Ensuite, passez au canal laser et éclairez la cellule selon le motif pendant trois minutes. Cela correspond à une dose de 6 000 millijoules par millimètre carré.
Ensuite, changez de canal et acquérez l’image des perles à l’état non déformé. Pour calculer les forces de traction, ouvrez les images de billes fluorescentes qui ont déjà corrigé la dérive latérale. L’analyse complète des forces de traction est détaillée dans le script ci-joint.
Pour vérifier l’adhésion sélective des cellules aux régions à micro-motifs à la surface des hydrogels, les échantillons ont été imagés par microscopie fluorescente à l’aide de protéines matricielles prémarquées et par microscopie à fond clair pour visualiser les cellules. Les propriétés mécaniques des hydrogels de polyacrylamide ont été modifiées en mélangeant différentes quantités d’acrylamide et de bis-acrylamide. La rigidité de l’hydrogel a été évaluée avec des expériences de nanoindentation par microscopie à force atomique.
Les mesures de la force de traction ont été effectuées après l’application d’un éclairage de faisceau laser ultraviolet contrôlé dans l’espace, temporellement, pour éclairer sélectivement des régions de la taille d’un micron de l’hydrogel de polyacrylamide. Les forces de traction ont été reconstruites en utilisant le FTTC régularisé avec un paramètre de régularisation choisi par validation croisée généralisée. Notre approche modulaire de modèle basée sur la microscopie à force d’attraction combinée à la lumière et à la libération de micro-motifs est polyvalente et pourrait être exploitée davantage avec d’autres configurations de microscopie et d’imagerie pour améliorer sa résolution et sa sensibilité.
