מערכת תאי תרבית משולשת המדגימה את מחסום הדם-מוח האנושי

אספקת תרופות למוח נותרה אתגר. הפיתוח של פאנלים גדולים של ננו-חומרים חדשים לשיפור ההעברה למוח מדגיש את הצורך במיקרו-מערכת חוץ-גופית אמיתית כדי לחזות חדירה למוח במסגרת של מבחנים פרה-קליניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לקרח את תאי הכאב החופשיים של מחסום הדם במוח בתוך אותה מערכת המאפשרת תקשורת תאי הנדרשת להשראת פנוטיפ מחסום הדם במוח.

יתר על כן, ניתן לבודד כל סוגי תאים בנפרד לצורך אנליזה מולקולרית נוספת. המודל יכול לשמש למגוון רחב של ניסויים בתנאים בריאים ופתולוגיים ומייצג כלי רב ערך להערכות פרה-קליניות של הובלת מולקולות וחלקיקים, כמו גם לסחר בין-תאי ותוך-תאי. המדגימים את ההליך יהיו ד"ר קלמנס דליין וד"ר אלאונורה ריצי.

התחל על ידי קידוד הבארות עם 500 מיקרוליטר של שני מיקרוגרם לסנטימטר מרובע פולי-L-ליזין פתרון. יש לדגור למשך לילה או למשך שעה לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ולהסיר בזהירות את תמיסת הפולי-L-ליזין בעזרת פיפטה מזכוכית המחוברת למערכת שאפתנית. לאחר מכן יש לשטוף פעמיים במים סטריליים.

כדי לאסוף את האסטרוציטים, תחילה לשטוף את האסטרוציטים פעם אחת עם 10 מיליליטר של 1X PBS CMF חם. דגירה אותם במשך שלוש דקות עם 10 מיליליטר של תמיסת EDTA חמה 20% טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני ו 21% חמצן. לנתק מכנית את התאים מן הבקבוקון ולהעביר את ההשעיה צינור חרוטי המכיל חמישה מיליליטר של FCS חם לא מדולל.

צנטריפוגה המתלה ב 190 פעמים G במשך חמש דקות ב 20 מעלות צלזיוס. להשעות מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של מדיום אסטרוציטים חם, ולאחר מכן לדלל 20 מיקרוליטר של ההשעיה התא עם 80 מיקרוליטר של 1X PBS CMF. ספרו את התאים באמצעות תא ספירה ידני תחת מיקרוסקופ.

צלחת סביב 40, 000 תאים לסנטימטר מרובע בכל Poly-L-ליזין מקודד מראש היטב בנפח של 1.5 מיליליטר של מדיום אסטרוציטים חם. הניחו את מסנני ההוספה שהוחזרו בשולי צלחת מכוסה בגובה 25 מילימטרים והוסיפו 250 מיקרוליטרים של תמיסת קולגן מסוג One למסנני ההוספה. לדגור בטמפרטורת החדר במשך שעה.

לאחר מכן הסר בזהירות את תמיסת הקולגן מסוג 1 עם פיפטה זכוכית המחוברת למערכת שאפתנית. יש לשטוף פעמיים עם 250 מיקרוליטר של גלוקוז גבוה DMEM בטמפרטורת החדר ולהסיר בזהירות את כל התמיסה ממסנני ההוספה. לשטוף את pericytes פעמיים עם 10 מיליליטר של חם 1X PBS CMF ולדגור את התאים עם שני מיליליטר של טריפסין חם.

התבונן בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לפקח על פעולת הטריפסין. כאשר התאים מתחילים להתנתק, הסר את הטריפסין, ולאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של מדיום בסיסי של תאי אנדותל חמים או ECM לתאים, והתחל דיסוציאציה מכנית. לדלל 20 מיקרוליטר של תרחיף התא עם 80 מיקרוליטר של 1X PBS CMF, ולספור את התאים באמצעות תא ספירה ידני תחת מיקרוסקופ כפי שהוצג קודם לכן.

זרע 44, 500 תאים בסנטימטר מרובע על מסנני ההכנסה המקודדים מראש בנפח של 250 מיקרוליטר. יש לשמור את מסנני ההחדרה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות מתחת ל-5% פחמן דו חמצני ו-21% חמצן. השתמש בפינצטה סטרילית כדי להחזיר בזהירות את מסנני ההוספה לתוך צלחת באר 12 המכילה 1.5 מיליליטר של ECM חם לכל באר.

מסנני ההוספה מוכנים כעת לציפוי בצד השני. מצפים את הצד העליון ואת מסננים להוסיף עם 500 microliters של הידרוג'ל מבוסס מטריצה חוץ תאית. מניחים את מסנני ההחדרה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני ו-21% חמצן למשך שעה.

לשטוף אותם פעם אחת עם 500 microliters של DMEM גלוקוז גבוה בטמפרטורת החדר. לשטוף את תרבית תאי האנדותל פעם אחת עם 10 מיליליטר של חם 1X PBS CMF ולדגור את התאים עם שני מיליליטר של טריפסין חם. הסר את טריפסין כאשר התאים מתחילים להתנתק, ולאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של ECM חם ולהתחיל דיסוציאציה מכנית.

לדלל 20 מיקרוליטר של תרחיף התא עם 80 מיקרוליטר של 1X PBS CMF ולספור את התאים באמצעות תא ספירה ידני. זרע את תאי האנדותל בצפיפות של 71, 500 תאים בסנטימטר מרובע על מסנני ההכנסה המקודדים מראש בנפח של 500 מיקרוליטר של ECM חם. החלף את מדיום האסטרוציטים עם 1.5 מיליליטר של ECM חם לכל באר.

לאחר מכן להעביר את מסנני הכנסה זרעים לבארות המכילות את האסטרוציטים. מקם את מערכות תאי שלוש התרביות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני ו-21% חמצן. יש להסיר את המדיום בזהירות מהתא העליון והתחתון באמצעות פיפטה מזכוכית המחוברת למערכת שאיפות.

החלף את המדיום ב- ECM חם בנפח של 500 מיקרוליטר בתא העליון ו- 1.5 מיליליטר בתא התחתון. לחדש את המדיום כל יומיים עד היום השישי על ידי חזרה על אותו הליך. לבסוף החזירו את התאים לאינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני ו-21% חמצן.

נתוני אימונוציטוכימיה אישרו את הביטוי של סמנים קונבנציונליים כגון בטא קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות דם ו-Desmine עבור פריציטים, וחלבון חומצי פיברילרי גליאלי עבור אסטרוציטים. לפיכך, לאחר שישה ימים של תרבית עם הפריסיטים והאסטרוציטים, המונו-שכבה של תאי אנדותל דמויי מוח או BLECs המתוארים עם צביעת הצומת הדביקה של Ve-Cadherin מציגה לוקליזציה מתמשכת של חלבוני TJ CLD5 ו- Z-01 בגבולות התא. חדירות פרא-תאית של BLECS לסמני שלמות BBB פלואורסצנטיים, נתרן פלואורסצין ודקסטרן FITC מוצגת כאן.

הצטברות תוך-תאית של R123 ב-BLECs הציגה עלייה משמעותית בנוכחות מעכב משאבת השטף אלקרידר בהשוואה למצב הבקרה עם היעדרו. זה מצביע על נוכחות של מולקולות משאבה efflux פעיל כלומר P גליקופרוטאין וחלבון עמידות לסרטן השד או BCRP ב BLEC של. ביטוי גנים של חלבוני צומת הדוקים, טרנספורטרים וקולטני מולקולות גדולות המנורמלים על ידי ביטוי של RPLP0 מוצגים כאן.

כאן, הערכים הגדולים מאחד מתאימים לביטוי גנים גבוה יותר במודל התרבית המשולשת. הקו האדום מתאים לערך של אחד שבו רמת הביטוי של שני המודלים שקולה. התמונה המייצגת מראה את רמת החלבון של חלבוני צומת הדוקים, טרנספורטרים, בקולטני מולקולות גדולות המנורמלות על ידי ביטוי של בטא אקטין.

ההובלה של ננו-ג'לים פולימריים ניטרליים מבוססי NIPAM המתויגים באופן פלואורסצנטי נבדקה. בזמן אפס, ננו-ג'לים פולימריים הונחו בתא הלומינלי בריכוז של 0.1 מיליגרם למיליליטר. לאחר 24 שעות של דגירה, 5.82% מהננו-ג'לים הפולימריים נמצאו בתא האבמינלי והוכיחו את יכולתם לחצות את ה-BLECs.

הציפוי והזריעה הנכונים של הפריציטים על המסנן שהוחזר הם מרכזיים. חשוב הוא תחזוקה של המבנים סטריליות ושלמות כדי למנוע זיהום של מערכת תרבית התא.