פרוטוקול זה מתאר בדיקה התנהגותית פשוטה המאפשרת ללמוד למידה אסוציאטיבית שלילית ואיחוד זיכרון בזבובים, כולל השפעות של אינטראקציות בסביבת הגנים. הבדיקה המוצגת כאן היא הליך פשוט, ניתן לשחזור וחסכוני לחקר מנגנוני זיכרון שניתן להרכיב בקלות עם כמה אספקה זמינה. בדיקה זו יכולה לספק תובנה לגבי מנגנונים בסיסיים העומדים בבסיס ליקויי למידה וזיכרון הנובעים ממניפולציות גנטיות, פרמקולוגיות ותזונתיות שונות.
מי שידגימו את ההליך הזה יהיו מורגן טדר וסטיבן בראדלי, סטודנטים לתואר ראשון מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לקדוח חור ארבעה מילימטרים בניצב כארבעה מילימטרים מלמטה בתוך צינור תרבית פוליפרופילן 14 מיליליטר. הסר את החלק העליון של צינור התרבות כדי להפוך שבר תחתון 45 מילימטר מנוצל כתא התחתון.
חותכים את החלק העליון של קצה פיפטה 1000 מיקרוליטר כדי ליצור שבר 12 מ"מ. הכנס את השבר לתוך החור ארבעה מילימטר של צינור התרבות כרציף טעינה כדי להעביר את הזבובים. חותכים חתיכה 15 מילימטר של צינורות ויניל שקופים ולהכניס את התא התחתון והעליון מקצוות מנוגדים לתוך הצינורות.
חבר את ההרכבה אנכית באמצעות מהדק מתכוונן דו-ראשי. אתר את התא העליון המחובר אנכית עם צינורות הלם. חבר את צינורות ההלם עם ממריץ חשמלי כדי ליצור זעזועים חשמליים.
באמצעות בלוק קר כקרח, לשתק זבובים בני שלושה עד ארבעה ימים ולהעביר אותם לבקבוקונים נפרדים עם מזון 24 שעות לפני הניסוי. הקצה קוד לכל הבקבוקונים כמתואר בכתב היד של הטקסט. בעדינות למצוץ זבוב אחד לתוך השאיפה בפה על ידי ציור אוויר.
הפקד את הזבוב על ידי נשיפה קלה לתוך רציף הטעינה ומיד התחל טיימר של דקה אחת ושעון עצר. הפעל את הממריץ ולספק הלם חשמלי כאשר הזבוב נכנס צינור ההלם. לחץ על שעון העצר כדי להקליט את ההשהיה הראשונה.
אם הזבוב נכנס שוב לצינור ההלם, לספק זעזועים נוספים. באמצעות ספירה או מונה מבוסס Arduino, להקליט את מספר הזעזועים במהלך משפט של דקה אחת. מעבירים בעדינות את הזבוב בחזרה לבקבוקון בסוף משפט של דקה אחת.
רשום את ההשהיה, את מספר הזעזועים שהתקבלו, וכל שינוי בולט בהתנהגות. באמצעות 70% אתנול, נקה את התא התחתון ואת התא ההלם. יש לנגב עם רקמת ניקוי ללא מוך ולייבש אותה באמצעות מייבש שיער.
חזור על המשפט עם הזבוב הבא. נקו את התא התחתון במים וחומר ניקוי חסר ריח לאחר השלמת הניסוי. באמצעות 70% אתנול, לנגב את התא התחתון ואת תא ההלם ואוויר יבש לילה.
על-ידי חזרה על התהליך שלעיל לאחר 24 שעות, בצע ניסוי שני. ברצף דומה, בדוק את הזבובים. לאחר ביצוע בדיקת הימנעות פסיבית בזבובים זכרים Drosophila melanogaster, התוצאות הראו כי ההשהיה עולה, מספר הזעזועים פוחתת, מה שמוכיח כי זבובים למדו קשר בין התא העליון להלם חשמלי.
התפלגות התדרים חשפה כי רוב הזבובים נכנסים לתא העליון ומקבלים זעזוע אחד עד שלושה זעזועים בניסוי הראשון. עד המשפט הרביעי, רוב הזבובים לא נכנסים לתא העליון ומקבלים אפס זעזועים. בניסויים הבאים, משך הניסוי צומצם לדקה אחת מכיוון שהתפלגות התדירות עבור השהיות הראתה בבירור שאם הזבוב אינו נכנס לתא העליון תוך 60 שניות בניסוי הראשון, הוא בדרך כלל אינו נכנס כלל.
ניסויי בדיקת ההימנעות הפסיבית חזרו על עצמם בזבובים זכרים ונקבות של דרוזופילה. התוצאות הראו כי הזבובים היו יעילים בלימוד התנהגות ההימנעות הפסיבית כפי שניתן לראות מהשינויים בהתפלגות התדרים עבור השהיות וזעזועים בזבובים זכריים ונקביים. השוואת השהיות ומספר הזעזועים בין זכר לנקבה לא חשפה הבדלים מובהקים סטטיסטית.
עם זאת, זבובים נקבות קיבלו מעט יותר זעזועים בכל משפט. ניתוח של התקפי טיפוח בניסויים 2 ו -3 גילה כי משך הזמן הכולל של טיפוח פוחת באופן משמעותי זבובים נשיים מניסוי אחד למשפט שלוש. זה מצביע על כך זבובים לחוות מתח התנהגותי אשר מקביל התנהגויות כמו חרדת מכרסמים.
השוואה של ההשפעות של דיאטה מערבית ופעילות גופנית טיסה על התנהגות הימנעות פסיבית להראות כי הדיאטה המערבית מקטינה את ההשהיה ומגדילה את מספר הזעזועים המצביעים על כך שהתזונה המערבית פוגעת בלמידה אסוציאטיבית מרתיעה בזבובים. לעומת זאת, פעילות גופנית בטיסה הקלה על ההשפעה השלילית של הדיאטה המערבית. בעת ניסיון הליך זה, זכור לא להדגיש זבובים.
זבובים לחוצים היו נכנסים לתא העליון מהר מדי או לא נכנסים בכלל. כל הניסויים צריכים להתבצע באותם תנאים סביבתיים ובאותו הזמן של היום. טכניקה זו מעניקה לחוקרים בדיקה פשוטה חדשה שניתן להשתמש בה כדי לנתח מנגנונים מהותיים של למידה ואיחוד זיכרון בזבובים.
