Bu protokol, gen ortamı etkileşimlerinin etkileri de dahil olmak üzere sineklerde olumsuz ilişkilendirilebilir öğrenme ve hafıza konsolidasyonunun incelenmesine izin veren basit bir davranışsal tahlil açıklanmaktadır. Burada sunulan test, mevcut birkaç malzemeyle kolayca monte edilebilen bellek mekanizmalarını incelemek için basit, tekrarlanabilir ve uygun maliyetli bir prosedürdür. Bu tahlil, çeşitli genetik, farmakolojik ve diyet manipülasyonlarından kaynaklanan öğrenme ve hafıza bozukluklarının altında kalan temel mekanizmalar hakkında fikir verebilir.
Bu prosedürü gösteren morgan Tedder ve Steven Bradley olacak, laboratuvarımdan lisans öğrencileri. Başlamak için, 14 mililitrelik polipropilen kültür tüpü içinde alttan yaklaşık dört milimetre dik olarak dört milimetrelik bir delik açın. Alt bölme olarak kullanılan 45 milimetrelik bir alt parça yapmak için kültür tüpünün üst kısmını çıkarın.
12 milimetrelik bir parça oluşturmak için 1000 mikrolitre pipet ucunun üst kısmını kesin. Sinekleri aktarmak için parçayı kültür tüpünün dört milimetrelik deliğine yükleme yuvası olarak yerleştirin. 15 milimetrelik şeffaf vinil boruyu kesin ve alt ve üst bölmeyi karşı uçlardan boruya yerleştirin.
Montajı iki uçlu ayarlanabilir bir kelepçe kullanarak dikey olarak takın. Üst bölmeyi şok tüpleriyle dikey olarak tutturulmuş olarak bulun. Elektrik şokları oluşturmak için şok tüplerini bir elektrik stimülatörü ile bağlayın.
Buz gibi bir blok kullanarak, üç ila dört günlük sinekleri hareketsiz hale getirip deneyden 24 saat önce yiyeceklerle ayrı şişelere aktarın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi tüm şişelere bir kod atayın. Hava çekerek ağız aspiratörüne bir sineği hafifçe emer.
Yükleme iskelesine hafifçe üfleyerek sineği yatırın ve hemen bir dakikalık zamanlayıcı ve kronometre başlatın. Uyarıcıyı açın ve sinek şok tüpüne girdiğinde bir elektrik şoku gerçekleştirin. İlk gecikmeyi kaydetmek için kronometreye basın.
Sinek şok tüpünü tekrar alırsa, ek şoklar sağlar. Bir çetele veya Arduino tabanlı bir sayaç kullanarak, bir dakikalık deneme sırasında şok sayısını kaydedin. Bir dakikalık denemenin sonunda sineği yavaşça şişeye geri aktarın.
Gecikmeyi, alınan şokların sayısını ve davranıştaki önemli değişikliği kaydedin. %70 etanol kullanarak alt ve şok bölmesini temizleyin. Tüy bırakmayan bir temizleme dokusuyla silin ve saç kurutma makinesi kullanarak kurutun.
Denemeyi bir sonraki sinekle tekrarlayın. Deneyi tamamladıktan sonra alt bölmeyi su ve kokusuz deterjanla temizleyin. %70 etanol kullanarak alt ve şok bölmesini silin ve gece boyunca hava kurutun.
Yukarıdaki işlemi 24 saat sonra tekrarlayarak ikinci bir deneme gerçekleştirin. Benzer bir sırayla sinekleri test edin. Drosophila melanogaster erkek sineklerinde pasif bir kaçınma tahlilini yaptıktan sonra, sonuçlar gecikmenin arttığını, şok sayısının azaldığını ve sineklerin üst bölme ile elektrik çarpması arasında öğrenilen ilişkiyi gösterdiğini göstermiştir.
Frekans dağılımı, çoğu sineklerin üst bölmeye girdiğini ve ilk denemede bir ila üç şok aldığını ortaya koydu. Dördüncü denemede, çoğu sinek üst bölmeye girmez ve sıfır şok alır. Sonraki deneylerde, deneme süresi bir dakikaya düşürüldü, çünkü gecikme süreleri için frekans dağılımı, sinek ilk denemede 60 saniye içinde üst bölmeye girmezse, genellikle hiç girmediğini açıkça gösterdi.
Pasif kaçınma tahlil deneyleri Drosophila simulans erkek ve dişi sineklerde tekrarlandı. Sonuçlar, sineklerin, erkek ve dişi sineklerdeki gecikme süreleri ve şoklar için frekans dağılımlarındaki değişikliklerden açıkça görüldüğü gibi pasif kaçınma davranışını öğrenmede etkili olduğunu göstermiştir. Erkek ve kadın arasındaki gecikme süreleri ve şok sayısının karşılaştırılması istatistiksel olarak anlamlı bir fark ortaya çıkarmadı.
Bununla birlikte, dişi sinekler her denemede biraz daha fazla şok aldı. İki ve üç denemelerde tımar nöbetlerinin analizi, deneme bir'den deneme üçe kadar kadın sineklerde toplam tımar süresinin önemli ölçüde azaldığını ortaya koydu. Bu, sineklerin kemirgen anksiyete benzeri davranışlarla paralellik gösteren davranışsal stres yaşadığını göstermektedir.
Batı diyetinin ve uçuş egzersizinin pasif kaçınma davranışı üzerindeki etkilerinin karşılaştırılması, Batı diyetinin gecikmeyi azalttığını ve Batı diyetinin sineklerde aversif ilişkilendirici öğrenmeyi bozdığını gösteren şokların sayısını artırdığını göstermektedir. Tersine, uçuş egzersizi Batı diyetinin olumsuz etkisini azalttı. Bu prosedürü denerken, sinekleri strese almameyi unutmayın.
Stresli sinekler ya üst bölmeye çok hızlı girer ya da hiç girmez. Tüm deneyler aynı çevresel koşullar altında ve günün aynı saatinde yapılmalıdır. Bu teknik, araştırmacılara sineklerde öğrenme ve hafıza konsolidasyonunun iç mekanizmalarını parçalamak için kullanılabilecek yeni bir basit test sağlar.
