このプロトコルは、遺伝子環境相互作用の影響を含むハエにおける有害な連想学習と記憶統合を研究することを可能にする単純な行動アッセイを記述する。ここで提示されるアッセイは、利用可能ないくつかの供給で簡単に組み立てることができるメモリ機構を研究するための簡単で、再現性があり、費用対効果の高い手順です。このアッセイは、様々な遺伝的、薬理学的、および食事操作に起因する学習および記憶障害の基礎となるメカニズムに関する洞察を提供することができる。
この手順を実証するには、私の研究室の学部生であるモーガン・テダーとスティーブン・ブラッドリーです。まず、14ミリリットルのポリプロピレン培養チューブ内で、底から約4ミリメートル垂直に4ミリメートルの穴を開けます。培養管の上部を取り出し、下側区画として利用した45ミリメートル底部を作ります。
1000マイクロリットルのピペットチップの上部を切り取り、12ミリメートルの断片を作成します。ハエを移送するローディングドックとして、培養管の4ミリメートル穴に断片を挿入します。透明なビニールチューブの15ミリメートル部分をカットし、反対側の端から下のコンパートメントと上部のコンパートメントをチューブに挿入します。
2 本の調整可能なクランプを使用して、アセンブリを垂直に取り付けます。ショックチューブに垂直に取り付けられた上部コンパートメントを見つけます。ショックチューブを電気刺激装置に接続して、感電を発生させる。
氷の冷たいブロックを使用して、3〜4日齢のハエを固定し、実験の24時間前に食べ物と別々のバイアルに移します。テキスト原稿に記載されているとおりに、すべてのバイアルにコードを割り当てます。空気を引いて口の吸引器に1つのハエをそっと吸い込みます。
軽く装填ドックに吹き込んでフライを堆積させ、すぐに1分間のタイマーとストップウォッチを開始します。刺激装置をオンにし、フライが衝撃管に入ったときに感電を引き起こす。ストップウォッチを押して、最初の待ち時間を記録します。
フライが衝撃管に再び入った場合は、追加の衝撃を与えます。集計またはArduinoベースのカウンターを使用して、1分間のトライアル中にショックの数を記録します。1分間のトライアルの終わりに、フライをバイアルにそっと振り返します。
待ち時間、受け取ったショックの数、および動作の顕著な変化を記録します。70%エタノールを使用して、下部およびショックコンパートメントを洗浄します。糸くずのない洗浄ティッシュで拭き取り、ヘアドライヤーを使用して乾燥させます。
次のフライでトライアルを繰り返します。実験を完了した後、水と無臭の洗剤で下のコンパートメントを清掃してください。70%エタノールを使用して、下部とショックコンパートメントを拭き取り、一晩空気乾燥します。
24時間後に上記の処理を繰り返して、第二の試用を行う。同様のシーケンスで、ハエをテストします。ショウジョウバエメラノガスター雄ハエで受動的回避アッセイを行った結果、遅延が増加し、ショックの数が減少し、ハエが上のコンパートメントと感電との間の関連を学習したことを示した。
周波数分布は、ほとんどのハエが上部コンパートメントに入り、最初の試験で1〜3回の衝撃を受けることを明らかにしました。4回目の試験では、ほとんどのハエは上部コンパートメントに入らず、ゼロショックを受けます。その後の実験では、レイテンシーの周波数分布が明らかに最初の試験で60秒以内に上のコンパートメントに入らない場合、それは全く入らないということを示したので、試験期間は1分に短縮されました。
受動回避アッセイ実験は、ショウジョウバエシミュランの雄と雌のハエで繰り返された。結果は、ハエが男性と女性のハエの待ち時間と衝撃の周波数分布の変化から明らかなように受動的回避行動を学習するのに効果的であることを示しています。男性と女性の間の待ち時間とショックの数の比較は、統計的に有意な違いを明らかにしなかった。
しかし、雌のハエは、各試験でわずかに多くのショックを受けました。試験2と3でのグルーミングバウトの分析は、試験1からトライアル3に雌のハエでグルーミングの総持続時間が大幅に減少することを明らかにしました。これは、ハエがげっ歯類の不安のような行動と平行する行動ストレスを経験することを示唆している。
西洋の食事と飛行運動が受動的回避行動に及ぼす影響を比較すると、西洋の食事は待ち時間を減らし、西洋の食事がハエの回避的な連想学習を損なうことを示すショックの数を増加させる。逆に、飛行運動は西洋の食事の悪影響を軽減した。この手順を試みるときは、ハエにストレスを与えないことを覚えておいてください。
ストレスを受けたハエは、上のコンパートメントに入りすぎたり、まったく入らないかのどちらかです。すべての実験は、同じ環境条件の下で、一日の同じ時間に行われるべきです。この技術は、ハエの学習と記憶の統合の本質的なメカニズムを解剖するために使用することができる新しい簡単なアッセイを研究者に与えます。
