Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Verhaltensassay, der es ermöglicht, nachteiliges assoziatives Lernen und Gedächtniskonsolidierung bei Fliegen zu untersuchen, einschließlich der Auswirkungen von Genumgebungsinteraktionen. Der hier vorgestellte Assay ist ein einfaches, reproduzierbares und kostengünstiges Verfahren zur Untersuchung von Speichermechanismen, die mit wenigen verfügbaren Verbrauchsmaterialien leicht zusammengestellt werden können. Dieser Assay könnte Einblicke in grundlegende Mechanismen geben, die Lern- und Gedächtnisstörungen zugrunde liegen, die sich aus verschiedenen genetischen, pharmakologischen und diätetischen Manipulationen ergeben.
Morgan Tedder und Steven Bradley, Studenten aus meinem Labor, werden dieses Verfahren demonstrieren. Bohren Sie zunächst ein vier Millimeter großes Loch senkrecht etwa vier Millimeter von unten in ein 14-Milliliter-Polypropylen-Kulturrohr. Entfernen Sie den oberen Teil des Kulturrohrs, um ein 45-Millimeter-Bodenfragment zu erstellen, das als unteres Fach verwendet wird.
Schneiden Sie die Oberseite einer 1000 Mikroliter Pipettenspitze ab, um ein 12-Millimeter-Fragment zu erzeugen. Stecken Sie das Fragment in das vier Millimeter große Loch des Kulturrohrs als Laderampe, um die Fliegen zu transportieren. Schneiden Sie ein 15 Millimeter großes Stück transparenten Vinylschlauch aus und setzen Sie das untere und obere Fach von gegenüberliegenden Enden in den Schlauch ein.
Befestigen Sie die Baugruppe vertikal mit einer zweizackigen verstellbaren Klemme. Positionieren Sie das obere Fach vertikal mit Stoßdämpferrohren befestigt. Verbinden Sie die Schockröhren mit einem elektrischen Stimulator, um elektrische Schläge zu erzeugen.
Verwenden Sie einen eiskalten Block, immobilisieren Sie drei bis vier Tage alte Fliegen und übertragen Sie sie 24 Stunden vor dem Experiment in separate Fläschchen mit Nahrung. Weisen Sie allen Fläschchen einen Code zu, wie im Textmanuskript beschrieben. Saugen Sie vorsichtig eine Fliege in den Mundsauger, indem Sie Luft ansaugen.
Legen Sie die Fliege ab, indem Sie leicht in die Laderampe blasen und starten Sie sofort einen Ein-Minuten-Timer und eine Stoppuhr. Schalten Sie den Stimulator ein und geben Sie einen elektrischen Schlag ab, wenn die Fliege in die Schockröhre eintritt. Drücken Sie die Stoppuhr, um die erste Latenz aufzuzeichnen.
Wenn die Fliege wieder in das Schockrohr eindringt, geben Sie zusätzliche Stöße ab. Notieren Sie mit einer Zählung oder einem Arduino-basierten Zähler die Anzahl der Schocks während einer einminütigen Studie. Übertragen Sie die Fliege am Ende einer einminütigen Probe vorsichtig zurück in die Durchstechflasche.
Zeichnen Sie die Latenz, die Anzahl der empfangenen Schocks und jede bemerkenswerte Verhaltensänderung auf. Reinigen Sie mit 70% Ethanol das untere und Stoßfach. Mit einem fusselfreien Reinigungstuch abwischen und mit einem Haartrockner trocknen.
Wiederholen Sie den Versuch mit der nächsten Fliege. Reinigen Sie das untere Fach nach Abschluss des Experiments mit Wasser und geruchlosem Reinigungsmittel. Wischen Sie mit 70% Ethanol das untere und das Schockfach ab und trocknen Sie es über Nacht an der Luft.
Wenn Sie den obigen Vorgang nach 24 Stunden wiederholen, führen Sie einen zweiten Versuch durch. Testen Sie in ähnlicher Reihenfolge die Fliegen. Nach der Durchführung eines passiven Vermeidungstests bei männlichen Fliegen von Drosophila melanogaster haben die Ergebnisse gezeigt, dass die Latenz zunimmt, die Anzahl der Schocks abnimmt, was zeigt, dass Fliegen eine Assoziation zwischen dem oberen Kompartiment und einem elektrischen Schlag gelernt haben.
Die Häufigkeitsverteilung ergab, dass die meisten Fliegen in das obere Kompartiment eindringen und im ersten Versuch ein bis drei Schocks erhalten. Beim vierten Versuch gelangen die meisten Fliegen nicht in das obere Kompartiment und erhalten keine Schocks. In nachfolgenden Experimenten wurde die Versuchsdauer auf eine Minute reduziert, da die Häufigkeitsverteilung für Latenzen deutlich zeigte, dass die Fliege, wenn sie im ersten Versuch nicht innerhalb von 60 Sekunden in das obere Kompartiment eindringt, in der Regel gar nicht eintritt.
Die Experimente mit dem passiven Vermeidungstest wurden bei männlichen und weiblichen Fliegen von Drosophila simulans wiederholt. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Fliegen das passive Vermeidungsverhalten effektiv lernten, wie es sich aus den Veränderungen der Häufigkeitsverteilungen für Latenzen und Schocks bei männlichen und weiblichen Fliegen ergibt. Der Vergleich der Latenzen und der Anzahl der Schocks zwischen Männern und Frauen ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede.
Weibliche Fliegen erhielten jedoch in jeder Studie etwas mehr Schocks. Die Analyse von Pflegeanfällen in den Studien zwei und drei ergab, dass die Gesamtdauer der Pflege bei weiblichen Fliegen von Der ersten bis zur dritten Studie signifikant abnimmt. Dies deutet darauf hin, dass Fliegen Verhaltensstress erfahren, der dem angstähnlichen Verhalten von Nagetieren entspricht.
Der Vergleich der Auswirkungen der westlichen Diät und der Flugübung auf das passive Vermeidungsverhalten zeigt, dass die westliche Diät die Latenz verringert und die Anzahl der Schocks erhöht, was darauf hindeutet, dass die westliche Ernährung das aversive assoziative Lernen bei Fliegen beeinträchtigt. Umgekehrt milderte Flugübungen die negativen Auswirkungen der westlichen Ernährung. Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, Fliegen nicht zu stressen.
Gestresste Fliegen würden entweder zu schnell oder gar nicht in das obere Fach eindringen. Alle Experimente sollten unter den gleichen Umgebungsbedingungen und zur gleichen Tageszeit durchgeführt werden. Diese Technik gibt Forschern einen neuen einfachen Assay, mit dem intrinsische Mechanismen des Lernens und der Gedächtniskonsolidierung bei Fliegen analysiert werden können.
