הפרוטוקול ממחיש כיצד לבצע מיקרוסקופיה של שלושה פוטונים במוחם של עכברים ובדגי זברה בוגרים. שתי מערכות מודל חשובות במדעי החיים. מיקרוסקופיה תלת-פוטונית באורך גל ארוך מאפשרת הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה של רקמות או איברים שלמים בעומקים שאינם נגישים על ידי מיקרוסקופיה דו-פוטונית.
טכניקה זו יכולה לעזור לנו להבין את המנגנונים הבסיסיים של מחלות נוירולוגיות, כגון אלצהיימר ואוטיזם, שם חסרה הבנה מלאה של האופן שבו המחלה משפיעה על המוח. המדגימה את הליך הדמיית המוח של העכבר תהיה קבאק צ'ו, חוקרת הפוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו והדגימה את הליך ההדמיה במוח של דגי הזברה תהיה קריסטין קולקמן, עמיתת מחקר ממעבדת המחקר של פטצ'ו. כדי להתחיל, הפעל את הלייזר והגדר את אורך הגל המרכזי של פלט האידלר של המגבר הפרמטרי האופטי הלא-קולינארי ב- 1, 300 או 1, 700 ננומטר, ולאחר מכן מקם מדחסי דופק על נתיב האור כדי לצייץ מראש את לייזר הפמטו-שניות ולמטב את משך הפולס להדמיה של שלושה פוטונים.
הגדר את הזווית בין לוח הסיליקון לנתיב הלייזר בזווית של ברוסטר כדי למקסם את העברת הלייזר, ולאחר מכן סובב את לוח הסיליקון כדי להשיג את הזווית של ברוסטר על ידי מזעור ההשתקפות. לאחר מכן, הניחו מראות סנפיר כדי לעבור בנוחות בין קווי הקרן של 1, 300 ו-1, 700 ננומטר. מניחים חצי לוחית גל המותקנת על שלב סיבוב ומפצל קרן מקטב כדי לשלוט בעוצמת הלייזר, ואז מניחים חוסם קרן בנתיב ההשתקפות של מפצל הקרן.
מכינים צלחת פטרי עם 0.5 ס"מ של 2% אגר נקודת התכה גבוהה. לאחר שהאגר התקרר והתמצק, חתכו חור מלבני באגר ארוך יותר ומעט רחב יותר מהדגים. באמצעות שעווה, הצמידו צינורות דקים לצלחת הפטרי עם קצה אחד במלבן וצינור בקוטר גדול יותר לקצה צלחת הפטרי.
לאחר מכן, מרדימים את הדג על ידי הנחתו בתמיסת טריקאין של 0.2 מיליגרם למיליליטר, ואז מניחים את הדג המרדים על צדו על ספוג רטוב, ולאחר מכן משתמשים במיקרו-מזרק, מזריקים באופן רטרו-מסלולי 3 מיקרוליטרים של פנקורוניום ברומיד כדי לשתק את הדג ומניחים אותו לזמן קצר בתמיסה של האנק כדי להבטיח שהוא משותק לחלוטין. לאחר מכן, מניחים את הדגים בצד הגב למעלה בצלחת הפטרי עם הראש לכיוון הצינורות, ואז משתמשים במלקחיים, פותחים בעדינות את פיו של הדג ומחליקים את הצינורות לתוך הפה. החליקו בעדינות את הדגים לכיוון הצינורות כך שהצינורות יהיו בחלק האחורי של פיו של הדג.
במהירות, אך בעדינות, מייבשים את האגר סביב הדגים ומסירים את המים על גבי הדגים. טובלים חתיכה קטנה של רקמת מעבדה בדבק מעבדה ומניחים את הרקמה על האגר משני צידי הדג ועל גבו של הדג אל הזימים. לאחר מכן, מרדימים את עורו של הדג על ידי הנחת טיפה קטנה של בופיוואקאין ישירות על פני השטח של הראש, ואז מביאים את צלחת הפטרי עם הדג למיקרוסקופ.
מלאו את המנה במי מתקן דגים והתחברו לצינורות למשאבת מים כדי לשאוב מי מערכת לתוך פיו של הדג. יש לוודא שהמים מחומצנים עם מבעבע ומתחממים ל-30 מעלות צלזיוס עם מחמם אקווריום. לצורך ההדמיה, הניחו מטרת הגדלה נמוכה על המיקרוסקופ בעל שלושת הפוטונים, ואז הניחו את צלחת הפטרי המכילה את הדגים והצינורות מתחת למיקרוסקופ והשתמשו במקור אור LED כדי להאיר את צלחת הפטרי.
מתוך תוכנת רכישת התמונה, פתח את מצב המצלמה, לחץ על Live, בחר ערוץ A בצד ימין של המסך והתאם את הגדרות ההיסטוגרמה כדי לראות את התמונה בבירור. לאחר הגדרת המנוע על בקר המנוע לבסיס, הנמיך את המטרה עד שהדג נראה לעין. הניחו את מרכז ראש הדג במרכז שדה הראייה, ואז הזיזו את המטרה למעלה והרחקו מראשו של הדג.
החלף את העדשה האובייקטיבית בהגדלה נמוכה בעדשה האובייקטיבית בעלת הצמצם המספרי הגבוה להדמיית שלושה פוטונים, ולאחר מכן הזז אותה קרוב לעבר ראשו של הדג. הגדר את ערכי הציר של כל המנועים לאפס. לאט לאט להוריד את העדשה האובייקטיבית, להבטיח כי המטרה לא מגע עם הראש פיזית.
בתוכנת מצלמת CCD, הפסק להזיז את המטרה כאשר החלק העליון של הראש גלוי והגדר את מיקומי X, Y ו- Z לאפס. כבה את מקור אור ה-LED וסגור את הווילון הכהה סביב המערכת, ולאחר מכן הגדר את תוכנת רכישת ההדמיה למצב GG מרובה-פוטון להדמיית שלושה פוטונים והגדר את העוצמה מתחת לעדשה האובייקטיבית לפחות ממילי-וואט אחד. לחץ על כפתור Live בתוכנת רכישת התמונות.
פתח ערוצי PMT והתאם את רווח ה- PMT ואת רמת הרקע לפי הצורך. התקדמו באיטיות במעלה העדשה האובייקטיבית כדי לאתר את פני השטח של הראש על ידי ניטור תעלת ה-THG מכלי הדם הגדולים ומשטח הזכוכית של החלון. לאחר הזזת העדשה האובייקטיבית קרוב לחלון, החל מים בין המטרה לחלון הגולגולת, ולאחר מכן הגדר את ערכי הציר של כל המנועים לאפס.
לחץ על כפתור Live בתוכנת רכישת התמונות. פתח ערוצי PMT והתאם את רווח ה- PMT ואת רמת הרקע לפי הצורך, ואז התקדם באיטיות במעלה העדשה האובייקטיבית כדי לאתר את פני השטח של החלקת הכיסוי על ידי ניטור תעלת ה- THG מכלי הדם הגדולים ומשטח זכוכית החלון. התאם את כיוון החלון במידת הצורך, ואז אפס את המנועים כדי להגדיר את פני השטח של המוח.
בצע הדמיה והתאם את רמת ההספק בהתאם לעומק ההדמיה. הדמיה ברזולוציה גבוהה, לא פולשנית ועמוקה של תאי עצב בעלי תווית גנטית במוח של דגי זברה בוגרים מושגת באמצעות מיקרוסקופיה של שלושה פוטונים. ניתן לראות גם את התפלגות שכבות התאים בטקטום האופטי ובמוח הקטן.
תכונת המצלמה של המיקרוסקופ שימשה לאיתור הדגים. הגולגולת נראית בתעלת THG, המסייעת לנווט במוח ולמצוא את המשטח העליון. ניתן להבחין בין תאי עצב עם יחס אות לרקע גבוה בעומק המוח הבוגר.
תמונות צבעוניות של שלושה פוטונים של נוירונים המסומנים ב-GCaMP6s וכלי דם המסומנים באדום טקסס יחד עם אותות THG במוח העכבר הבוגר מוצגים כאן. עם אופטימיזציה של ההתקנה, תמונות עם ניגודיות גבוהה התקבלו בהצלחה עד 1.2 מילימטרים מפני השטח של המוח באזור ההיפוקמפוס CA1. עקבות פעילות סידן של נוירונים המסומנים על-ידי GCaMP6s בעומק של 750 מיקרומטרים לצורך סשן הקלטה של 10 דקות הראו נאמנות הקלטה גבוהה.
הגדרה זו יכולה לעזור לדמיין את הפעילות העצבית כדי להבין את תפקוד המוח. ניתן להשתמש בו גם כדי לעקוב אחר תנועת התאים בתוך הרקמה הביולוגית כדי להבין מערכות ביולוגיות שונות. בנוסף, ניתן למדוד את מהירות זרימת הדם גם כדי לעקוב אחר בריאות החיה.
