פרוטוקול מפורט זה מתאר שיטה יעילה וחסכונית מאוד של ביטוי חיידקי עבור תחום קטליטי MMP-3 רקומביננטי ב- E.Coli, אשר ניתן ליישם על מטרות טיפוליות MMP אחרות. E.coli חסר מערכת קיפול חלבון מורכבת ועיבוד לאחר התרגום. שיטה זו משתמשת בזן התא R2DP כדי לשפר את ביטוי החלבון האוקריוטי ב- E.coli.
ייצור יתר של MMPs ספציפי מוביל למספר מחלות כמו סרטן, מחלות לב וכלי דם, ומחלות ניווניות. MMPs מסיסים פעילים נדרשים לפיתוח של טיפולים מעכבי MMP. לחסן מושבה מבודדת אחת של pET התג שלו פרו MMP-3 קטליטי תחום טרנספורמטי טרנספורמטי מ צלחת עמידה אמפיצילין כלורמפניקול LB בחמישה מיליליטרים של LB אמפיצילין אמפיצילין כלורמפניקול עמיד מדיה ב 37 מעלות צלזיוס.
שמור aliquots מכל תרבות ולהכין 40% מניות גליצרול. לחסן בקבוקון ליטר אחד המכיל 500 מיליליטר של LB אמפיצילין כלורמפניקול עמיד בינוני לצפיפות אופטית של 0.05 עד 0.1 ב 600 ננומטר עם תרבות הלילה. למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר בכמה נקודות זמן, בדרך כלל במשך שלוש עד ארבע שעות עד שהוא נופל בין 0.4 ל 0.6.
לגרום לתרבויות עם מניית IPTG טוחנת אחת לריכוז סופי של מילימטר אחד. דגירה בשייקר 37 מעלות במשך שלוש עד ארבע שעות נוספות. צנטריפוגה התאים בבקבוקים חרוטיים 250 מיליליטר ב 13, 000 G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, חוזר עד התרביות הם גלולה לחלוטין.
הוסף שלושה מיליליטרים של מאגר תמוגה לגרם של גלולה ו resuspend את הכדור על ידי מערבולת או pipetting. הוסף 1.25 מיליליטר של 10% משקל לפי נפח נתרן deoxycholate לליטר אחד של תרבות. הוסף 10 מיקרוליטרים של DNase I לליטר אחד של תרבות.
יש לנער בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ב-150 סל"ד. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13, 000 G וארבע מעלות צלזיוס. זרוק את הסופר-טבעי.
Resuspend את הכדור ב 100 מיליליטר לכל ליטר תרבות של חיץ גוף הכללה על ידי צנרת למעלה ולמטה. שמור את הדגימות על קרח במהלך sonication כדי למנוע התחממות יתר. Sonicate כל מדגם במשך שישה מחזורים של 15 שניות, פלט של חמש ו 50% דופק.
צנטריפוגה הדגימות במשך 10 דקות ב 13, 000 G וארבע מעלות צלזיוס. תבדוק את הכדור. אם הכדור הוא קומפקטי, להשליך את supernatant.
תנצל מחדש כל גלולה מתרבות של ליטר אחד וחמישה מיליליטר של חיץ סולבילגיזציה. דגירה במשך 30 דקות לפחות על קרח כדי לאפשר לחלבונים להתייבש. צנטריפוגה התאים במשך 10 דקות ב 13, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.
אם הכדור נוצר לאחר צנטריפוגה, לשפוך את supernatant לתוך צינור חרוט נפרד 50 מיליליטר. resuspend את הכדור בעוד חמישה מיליליטרים של חיץ solubilization לליטר אחד של תרבות על ידי צנרת למעלה ולמטה. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13, 000 G וארבע מעלות צלזיוס.
הבא, למשוך את supernatants. להשליך את הכדור או לאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עבור sonication נוסף. ריק מול מאגר שטיפה HT ולתעד את A280 של שבר הכביסה הראשון.
חזור על הפעולה עם שברים אחרים עד ש- A280 מתקרב לקו הבסיס. מיד לברוח חלבונים מתויגים שלו על ידי הוספת חמישה מיליליטרים של חוצץ HT elution. לאסוף את הזרימה דרך ב 0.5 עד שברי מיליליטר אחד בצינורות microfuge שכותרתו HT elution.
מדוד את A280 של שבר ההמלטה. אם A280 גדול מ- 0.3 מיליגרם למיליליטר, דלל את השבר באמצעות מאגר שיווי משקל HT. הטביעו את שברי ה-MMP המנופחים בצינורות דיאליזה בליטר אחד של מאגר דיאליזה אחד וערבבו את הצינורות ותכולתם על מערבוב מגנטי במשך שמונה שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס.
מעבירים לליטר אחד של מאגר דיאליזה 2 ומערבבים את הצינורות ותכולתם על מערבוב מגנטי במשך שמונה שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מעבירים לליטר אחד של מאגר דיאליזה שלוש ומערבבים את הצינורות ותכולתם על מערבבה מגנטית במשך לא פחות משמונה שעות בארבע מעלות צלזיוס. העבר את הדגימה לגורם מכיל מתאים ותייג אותם כ- MMP שעבר חיוג.
תבדוק את הצינור כדי למצוא משקעים. לכל מיליליטר aliquot של מיליגרם אחד למיליליטר MMP, להוסיף 50 microliters של APMA 20 מילימולרי כדי להגיע לריכוז APMA הסופי של מילימולר אחד. אם נוצר משקעים, צנטריפוגה במהירות המרבית במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
אחסן את supernatant בצינור microfuge 1.5 מיליליטר שכותרתו MMP פעיל. השלך את המשקעים לתוך מיכל מסומן עבור פסולת APMA. SDS-PAGE הופעל כדי להשוות את שברי ההמלטה של טיהור התג שלו של התחום הקטליטי Pro MMP-3 של התג שלו מתאי BL21 DE3 בתאי R2DP.
שמונת שברי ההמלטה הראשונים של התחום הקטליטי MMP המתויג שלו ותאי BL21 DE3 הראו חלבון קטן יותר מאלה שבתחום הקטליטי MMP המתויג בתאי R2DP. השברים המושרים, המרוכזים, המרוכזים, המופעלים והמותפלים של תאי תקליטור MMP3 ו- R2DP מוצגים. עם ההפעלה, המשקל המולקולרי של רצועת התקליטורים MMP-3 המופעלת הוא כ -20 קילודלטון, בניגוד לזימוגן המתויג שלו שנשאר בסביבות 30 קילודלטון.
כאשר צנטריפוגת תאים lysates, כדורי לא יכול להיות קומפקטי. כאשר זה קורה, sonicate יותר צנטריפוגה ארוכה יותר. בעת שחזור החלבון, משקעים עלולים להתרחש.
להמיס אותו במאגר solubilization ולחזור על התהליך. ההליך המתואר כאן מספק שיטה מפורטת לביטוי מסיס של MMPs אנושיים פעילים שניתן להשתמש בהם בסופו של דבר כדי להבין את המנגנון המולקולרי של פעילות אנזימטית MMP. שיטות חלופיות לטיהור חלבונים כגון FPLC יכולות להתבצע לחלבוני MMP מטוהרים.
