يصف هذا البروتوكول المفصل طريقة عالية الكفاءة وفعالة من حيث التكلفة للتعبير البكتيري للمجال الحفاز MMP-3 المؤتلف في E.Coli ، والتي يمكن تطبيقها على الأهداف العلاجية MMP الأخرى. تفتقر E.coli إلى نظام معقد للطي البروتيني ومعالجة ما بعد الترجمة. تستخدم هذه الطريقة سلالة الخلايا R2DP لتعزيز تعبير البروتين حقيقي النواة في E.coli.
الإفراط في إنتاج MMPs محددة يؤدي إلى العديد من الأمراض مثل السرطان والقلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية التنكسية. هناك حاجة إلى MMPs قابلة للذوبان النشطة لتطوير العلاجات المثبطة MMP. قم بتلقيح مستعمرة معزولة واحدة من المجال الحفاز pET His-tag pro MMP-3 المحول من لوحة مقاومة للأمبيسلين كلورامفينيكول LB في خمسة ملليلترات من وسائط مقاومة للأمبيسيلين كلورامفينيكول LB عند 37 درجة مئوية.
حفظ aliquots من كل ثقافة وإعداد 40 ٪ من مخزونات الجلسرين. قم بتلقيح قارورة سعة لتر واحد تحتوي على 500 ملليلتر من وسط مقاومة لكلورامفينيكول الأمبيسلين LB إلى كثافة بصرية تتراوح من 0.05 إلى 0.1 عند 600 نانومتر مع الثقافة الليلية. قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر في عدة نقاط زمنية ، عادة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات حتى تقع بين 0.4 و 0.6.
حث الثقافات مع مخزون IPTG مولاري واحد إلى تركيز نهائي من ملليمولار واحد. احتضان في شاكر 37 درجة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات إضافية. الطرد المركزي للخلايا في زجاجات مخروطية 250 ملليلتر في 13،000 غرام وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، مع تكرار حتى يتم تكوير الثقافات بالكامل.
أضف ثلاثة ملليلترات من مخزن التحلل العازل لكل غرام من الكريات وأعد تعليق الكريات عن طريق الدوامة أو السحب. أضف 1.25 ملليلتر من وزن 10٪ حسب حجم ديوكسيكولات الصوديوم لكل لتر واحد من الثقافة. أضف 10 ميكرولترات من DNase I لكل لتر واحد من الثقافة.
رجه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة عند 150 دورة في الدقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 13000 جم وأربع درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
أعد تعليق الكريات في 100 ملليلتر لكل لتر من المخزن المؤقت لجسم التضمين عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتفظ بالعينات على الجليد أثناء الصوتنة لمنع ارتفاع درجة الحرارة. قم بسونيك كل عينة لمدة ست دورات مدتها 15 ثانية ، وخرج من خمسة ونبض 50٪.
الطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق عند 13،000 غرام وأربع درجات مئوية. تحقق من الكريات. إذا كانت الكريات مدمجة ، فتخلص من السوبرناتانت.
أعد تعليق كل حبيبة من مزرعة لتر واحد وخمسة ملليلترات من المخزن المؤقت للذوبان. احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل على الجليد للسماح للبروتينات بالذوبان. الطرد المركزي للخلايا لمدة 10 دقائق في 13،000 مرة G في أربع درجات مئوية.
إذا تشكلت الكرية بعد الطرد المركزي ، صب supernatant في أنبوب مخروطي منفصل 50 ملليلتر. أعد تعليق الكريات في خمسة ملليلترات أخرى من المخزن المؤقت للذوبان لكل لتر واحد من الثقافة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 13000 جم وأربع درجات مئوية.
بعد ذلك ، اسحب السوبرناتونات. تخلص من الكريات أو خزنها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمزيد من الصوتنة. فارغ ضد المخزن المؤقت لغسيل HT وسجل A280 لجزء الغسيل الأول.
كرر ذلك مع الكسور الأخرى حتى يقترب A280 من خط الأساس. قم على الفور بالتخلص من البروتينات الموسومة عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من مخزن HT elution المؤقت. جمع التدفق من خلال 0.5 إلى واحد ملليلتر الكسور في أنابيب microfuge المسمى HT elution.
قم بقياس A280 لكسر الاستلصال. إذا كان A280 أكبر من 0.3 ملليغرام لكل ملليلتر، فقم بتخفيف الكسر باستخدام مخزن مؤقت لتوازن HT. اغمر أجزاء MMP المنبعثة في أنابيب غسيل الكلى في لتر واحد من المخزن المؤقت لغسيل الكلى واحد وحرك الأنبوب ومحتوياته على تحريك مغناطيسي لمدة ثماني ساعات على الأقل عند أربع درجات مئوية.
نقل إلى لتر واحد من غسيل الكلى المخزن المؤقت اثنين وتحريك الأنابيب ومحتوياتها على تحريك مغناطيسي لمدة ثماني ساعات على الأقل عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، انقل إلى لتر واحد من المخزن المؤقت لغسيل الكلى ثلاثة وحرك الأنابيب ومحتوياتها على تحريك مغناطيسي لمدة لا تقل عن ثماني ساعات عند أربع درجات مئوية. انقل العينة إلى حاوية مناسبة وقم بتصنيفها على أنها MMP مطلوبة.
افحص الأنبوب بحثا عن أي راسب. لكل ملليلتر واحد من أليكوت واحد ملليغرام لكل ملليلتر MMP ، أضف 50 ميكرولتر من 20 ملليمول APMA للوصول إلى تركيز APMA النهائي من ملليمول واحد. إذا تشكل راسب ، فقم بطرده المركزي بسرعة قصوى لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
قم بتخزين السوبرناتانت في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر يحمل علامة MMP المنشطة. تخلص من الراسب في حاوية تحمل علامة نفايات APMA. تم تشغيل SDS-PAGE لمقارنة كسور تنقية العلامة الخاصة به من المجال الحفاز His-tag pro MMP-3 من خلايا BL21 DE3 في خلايا R2DP.
أظهرت الكسور الثمانية الأولى من المجال الحفاز MMP الموسوم وخلايا BL21 DE3 بروتينا أقل من تلك الموجودة في المجال الحفاز MMP الموسوم به في خلايا R2DP. يتم عرض الأجزاء المستحثة والمعاد طيها والمركزة والمنشطة والمملحة من خلايا MMP3 CD و R2DP. عند التنشيط ، يبلغ الوزن الجزيئي لنطاق القرص المضغوط MMP-3 المنشط حوالي 20 كيلودالتون ، على عكس الزيموجين الموسوم الذي يبقى عند حوالي 30 كيلودالون.
عند الطرد المركزي للخلايا ، قد لا تكون الكريات مضغوطة. عندما يحدث ذلك ، سونيك أكثر وأجهزة الطرد المركزي لفترة أطول. عند إعادة تركيز البروتين ، قد يحدث هطول الأمطار.
قم بإذابته في مخزن مؤقت للذوبان وكرر العملية. يوفر الإجراء الموضح هنا طريقة مفصلة للتعبير القابل للذوبان عن MMPs البشرية النشطة التي يمكن استخدامها في النهاية لفهم الآلية الجزيئية للنشاط الأنزيمي MMP. يمكن إجراء طرق تنقية البروتين البديلة مثل FPLC لبروتينات MMP النقية.
