亲和色谱法表达和纯化人基质金属蛋白酶-3

该详细方案描述了一种高效且具有成本效益的细菌表达方法，用于大肠杆菌中的重组MMP-3催化结构域，可应用于其他MMP治疗靶点。大肠杆菌缺乏复杂的蛋白质折叠和翻译后处理系统。该方法使用R2DP细胞株来增强大肠杆菌中的真核蛋白表达。

特定MMP的过度生产会导致多种疾病，如癌症，心血管和神经退行性疾病。活性可溶性MMP是开发MMP抑制疗法所必需的。在37摄氏度下，将来自LB氨苄西林氯霉素耐药板的单个分离的pET His-tag pro MMP-3催化结构域转化剂接种在5毫升LB氨苄西林氯霉素耐药培养基中。

从每种培养物中保存等分试样并制备40%甘油储备。用过夜培养物将含有500毫升LB氨苄西林耐氯霉素培养基的一升烧瓶接种至光学密度为0.05至0.1的600纳米。在多个时间点测量600纳米处的光密度，通常持续三到四个小时，直到它落在0.4和0.6之间。

用一摩尔IPTG储备诱导培养物至终浓度为1毫摩尔。在37度的摇床中再孵育三到四个小时。将细胞在250毫升锥形瓶中以13， 000 G和4摄氏度离心10分钟，重复直到培养物完全沉淀。

每克沉淀加入三毫升裂解缓冲液，并通过涡旋或移液重悬沉淀。每升培养物加入1.25毫升重量为10%体积的脱氧胆酸钠。每升培养物加入10微升DNA酶I。

在室温下以150 RPM振荡30分钟。在13， 000 G和4摄氏度下离心10分钟。丢弃上清液。

通过上下移液将沉淀重悬在每升培养物100毫升的包涵体缓冲液中。在超声处理过程中将样品放在冰上，以防止过热。对每个样品进行超声处理，共六个周期，每次15秒，输出5次，脉冲50%。

将样品在13， 000 G和4摄氏度下离心10分钟。检查颗粒。如果沉淀是紧凑的，则丢弃上清液。

从一升培养物和五毫升增溶缓冲液中重悬每个沉淀。在冰上孵育至少30分钟，以使蛋白质溶解。将细胞在4摄氏度的13， 000倍G下离心10分钟。

如果沉淀在离心后形成，则将上清液倒入单独的50毫升锥形管中。通过上下移液，将沉淀重悬在每一升培养物的另外五毫升增溶缓冲液中。在13， 000 G和4摄氏度下离心10分钟。

接下来，拉动上清液。丢弃颗粒或将其储存在零下80摄氏度以进行额外的超声处理。对照HT洗涤缓冲液空白，并记录第一个洗涤馏分的A280。

对其他分数重复上述步骤，直到 A280 接近基线。通过加入5毫升HT洗脱缓冲液立即洗脱His标记的蛋白质。在标有HT洗脱的微量离心管中以0.5至1毫升级分收集流出物。

测量洗脱分数的A280。如果A280大于每毫升0.3毫克，则用HT平衡缓冲液稀释馏分。将洗脱的MMP级分浸没在透析管中，放入一升透析缓冲液中，并在四摄氏度下在磁搅拌下搅拌管及其内容物至少八小时。

转移到一升透析缓冲液二中，并在四摄氏度下用磁搅拌搅拌器搅拌管子及其内容物至少八小时。接下来，转移到一升透析缓冲液三中，并在四摄氏度下用磁搅拌搅拌器搅拌管子及其内容物不少于八小时。将样品转移到适当的容器中，并将其标记为拨号MMP。

检查试管是否有任何沉淀物。每毫升1毫升等分试样每毫升1毫克，加入50微升20毫摩尔APMA，达到1毫摩尔的最终APMA浓度。如果形成沉淀物，请在4摄氏度下以最大速度离心10分钟。

将上清液储存在标有活化MMP的1.5毫升微量离心管中。将沉淀物丢弃到标有APMA废物的容器中。运行SDS-PAGE以比较来自R2DP细胞中BL21 DE3细胞的His-tag pro MMP-3催化结构域的His-tag纯化洗脱组分。

在R2DP细胞中，His标记的MMP催化结构域和BL21 DE3细胞的前八个洗脱组分显示出比His标记的MMP催化结构域中的蛋白质少的蛋白质。显示了MMP3 CD和R2DP细胞的诱导，重折叠，浓缩，活化和脱盐部分。激活后，激活的MMP-3 CD条带的分子量约为20千道尔顿，而His标记的酶原仍保持在30千道尔顿左右。

当离心细胞裂解物时，沉淀可能不紧凑。发生这种情况时，超声处理更多，离心时间更长。当重新浓缩蛋白质时，可能会发生沉淀。

将其溶解在增溶缓冲液中并重复该过程。这里描述的程序为活性人MMPs的可溶性表达提供了详细的方法，最终可用于了解MMP酶活性的分子机制。可以对纯化的MMP蛋白进行替代蛋白质纯化方法，例如FPLC。