この詳細なプロトコールは、他のMMP治療標的に適用することができる、大腸菌における組換えMMP−3触媒ドメインに対する細菌発現の非常に効率的かつ費用対効果の高い方法を記載している。大腸菌は、複雑なタンパク質折り畳みおよび翻訳後プロセシングシステムを欠いている。この方法は、R2DP細胞株を使用して、大腸菌における真核生物タンパク質発現を増強する。
特定のMMPの過剰産生は、癌、心臓血管疾患、および神経変性疾患のようないくつかの疾患をもたらす。活性可溶性MMPは、MMP阻害治療薬の開発に必要である。LBアンピシリンクロラムフェニコール耐性プレートからpET His-tagプロMMP-3触媒ドメイン形質転換体の単離コロニーを、摂氏37度で5ミリリットルのLBアンピシリンクロラムフェニコール耐性培地に接種する。
各培養物からアリコートを保存し、40%グリセロールストックを調製する。500ミリリットルのLBアンピシリンクロラムフェニコール耐性培地を含む1リットルフラスコに、600ナノメートルで0.05〜0.1の光学密度で一晩培養して接種する。600ナノメートルの光学密度をいくつかの時点で測定し、通常は0.4〜0.6の間に収まるまで3〜4時間測定します。
1モルのIPTGストックを用いて培養物を1ミリモルの最終濃度に誘導する。37度振とう機でさらに3〜4時間インキュベートする。細胞を250ミリリットルの円錐形のボトルに入れ、13、000G、摂氏4度で10分間遠心分離し、培養物が完全にペレットになるまで繰り返す。
ペレット1グラムあたり3ミリリットルの溶解バッファーを加え、ボルテックスまたはピペッティングによってペレットを再懸濁する。培養物1リットル当たり10重量%重量%のデオキシコール酸ナトリウムを1.25ミリリットル加える。培養物1リットルあたり10マイクロリットルのDNase Iを加える。
室温で150RPMで30分間振る。13、000 G、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を捨てる。
ペレットを封入体緩衝液の1リットル当たり100ミリリットルの培養液に再懸濁し、上下にピペッティングする。過熱を防ぐために超音波処理中に氷の上にサンプルを保管してください。15秒の6サイクル、5の出力と50%パルスのために各サンプルを超音波処理します。
サンプルを13、000Gおよび摂氏4度で10分間遠心分離する。ペレットを確認してください。ペレットがコンパクトな場合は、上清を捨てる。
各ペレットを1リットルの培養物および5ミリリットルの可溶化緩衝液から再懸濁する。タンパク質が可溶化できるように、氷上で少なくとも30分間インキュベートする。細胞を摂氏4度で13,000倍Gで10分間遠心分離する。
遠心分離後にペレットが形成された場合は、上清を別の50ミリリットルの円錐管に注ぎます。ペレットを、上下にピペッティングすることにより、培養物1リットル当たりさらに5ミリリットルの可溶化緩衝液に再懸濁する。13、000 G、摂氏4度で10分間遠心分離します。
次に、上澄み液を引き上げます。ペレットを捨てるか、追加の超音波処理のために摂氏マイナス80度で保管してください。HT洗浄バッファーに対してブランクにし、第1の洗浄画分のA280を記録した。
A280がベースラインに近づくまで、他のフラクションで繰り返します。5ミリリットルのHT溶出バッファーを加えてHisタグ付きタンパク質を直ちに溶出させる。HT溶出と標識されたマイクロフュージチューブ内の0.5〜1ミリリットル画分でフロースルーを収集する。
溶出画分のA280を測定する。A280が1ミリリットルあたり0.3ミリグラムを超える場合は、HT平衡化バッファーで画分を希釈します。透析チューブ中の溶出したMMP画分を1リットルの透析緩衝液1つに沈め、チューブおよびその内容物をマグネチックスターで摂氏4度で少なくとも8時間撹拌する。
1リットルの透析バッファーに2本移し、チューブとその内容物をマグネチックスターで4°Cで少なくとも8時間攪拌する。次に、1リットルの透析バッファー3に移し、チューブとその内容物をマグネチックスターで摂氏4度で8時間以上攪拌する。サンプルを適切な容器に移し、ダイヤルされたMMPとしてラベルを付けます。
チューブに沈殿物がないか調べます。MMP当たり1ミリグラムの1ミリリットルアリコート当たり、20ミリモルAPMAを50マイクロリットル加えて、最終APMA濃度を1ミリモルに達する。沈殿物ができたら、最高速度で摂氏4度で10分間遠心分離します。
上清を活性化MMPと標識した1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに保存する。沈殿物をAPMA廃棄物のマークの付いた容器に廃棄する。SDS−PAGEは、R2DP細胞におけるBL21 DE3細胞からのHisタグプロMMP−3触媒ドメインのHis−tag精製溶出画分を比較するために実行した。
Hisタグ付きMMP触媒ドメインおよびBL21 DE3細胞の最初の8つの溶出画分は、R2DP細胞におけるHisタグ付きMMP触媒ドメインの溶出画分よりも少ないタンパク質を示した。MMP3 CDおよびR2DP細胞の誘導、リフォールディング、濃縮、活性化、および脱塩画分が示されている。活性化すると、活性化されたMMP-3 CDバンドの分子量は約20キロダルトンであり、Hisタグ付きザイモゲンは約30キロダルトンにとどまる。
細胞溶解物を遠心分離する場合、ペレットはコンパクトではないかもしれない。それが起こるとき、より超音波処理し、より長く遠心分離する。タンパク質を再濃縮すると、沈殿が生じることがある。
可溶化バッファーに溶かし、このプロセスを繰り返します。ここで記載される手順は、最終的にMMP酵素活性の分子機構を理解するために使用することができる活性ヒトMMPsの可溶性発現のための詳細な方法を提供する。FPLCなどの代替タンパク質精製方法を用いて、MMPタンパク質を精製することができる。
