Este protocolo detalhado descreve um método altamente eficiente e econômico de expressão bacteriana para domínio catalítico MMP-3 recombinante em E.Coli, que pode ser aplicado a outros alvos terapêuticos MMP. E.coli carece de um complexo sistema de dobramento de proteínas e processamento pós-translacional. Este método usa a cepa de células R2DP para melhorar a expressão de proteína eucariótica em E.coli.
A superprodução de MMPs específicos leva a várias doenças como câncer, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. Os MMPs solúveis ativos são necessários para o desenvolvimento de MMP inibindo terapêuticas. Inocular uma única colônia isolada de pET His-tag pro MMP-3 catalítico domínio transformador de uma placa resistente à anfillina LB em cinco mililitros de mídia resistente à anfillina LB a 37 graus Celsius.
Salve alíquotas de cada cultura e prepare estoques de 40% de glicerol. Inocular um frasco de um litro contendo 500 mililitros de clororamfenicol de ampicillina LB ao meio óptico de 0,05 a 0,1 a 600 nanômetros com a cultura da noite para o dia. Meça a densidade óptica em 600 nanômetros em vários pontos de tempo, normalmente por três a quatro horas até que caia entre 0,4 e 0,6.
Induzir as culturas com um estoque molar IPTG a uma concentração final de um mililitro. Incubar no agitador de 37 graus por mais três a quatro horas. Centrifugar as células em garrafas cônicas de 250 mililitros a 13.000 G e 4 graus Celsius por 10 minutos, repetindo até que as culturas sejam totalmente pelotas.
Adicione três mililitros de tampão de lise por grama de pelota e resuspende a pelota por vórtice ou pipetação. Adicione 1,25 mililitros de 10% de peso por volume de desoxicolato de sódio por um litro de cultura. Adicione 10 microliters de DNase I por um litro de cultura.
Agite à temperatura ambiente por 30 minutos a 150 RPM. Centrífuga por 10 minutos a 13.000 G e 4 graus Celsius. Descarte o supernatante.
Resuspende a pelota em 100 mililitros por litro de cultura de inclusão de tampão corporal por pipetar para cima e para baixo. Mantenha as amostras no gelo durante a sonicação para evitar superaquecimento. Sonicar cada amostra por seis ciclos de 15 segundos, uma saída de cinco e um pulso de 50%.
Centrifugar as amostras por 10 minutos a 13.000 G e 4 graus Celsius. Verifique a pelota. Se a pelota for compacta, descarte o supernasce.
Resuspenda cada pelota de uma cultura de um litro e cinco mililitros de tampão de solubilização. Incubar por pelo menos 30 minutos no gelo para permitir que as proteínas solubilizem. Centrifugar as células por 10 minutos a 13.000 vezes G em quatro graus Celsius.
Se a pelota se formar após a centrifugação, despeje o sobrenatante em um tubo cônico separado de 50 mililitros. Resuspenda a pelota em outros cinco mililitros de tampão de solubilização por um litro de cultura, pipetando para cima e para baixo. Centrífuga por 10 minutos a 13.000 G e 4 graus Celsius.
Em seguida, puxe os supernantes. Descarte a pelota ou armazene-a a menos 80 graus Celsius para sônica adicional. Em branco contra o tampão de lavagem HT e registe o A280 da primeira fração de lavagem.
Repita com outras frações até que o A280 se aproxime da linha de base. Imediatamente elute Suas proteínas marcadas adicionando cinco mililitros de tampão de eluição HT. Colete o fluxo de 0,5 a um mililitro frações em tubos de microfumes rotulados de eluição HT.
Meça o A280 da fração de eluição. Se o A280 for superior a 0,3 miligramas por mililitro, dilui a fração com tampão de equilíbrio HT. Submergir as frações de MMP elucidas em tubos de diálise em um litro de tampão de diálise um e agitar o tubo e seu conteúdo em uma agitação magnética por pelo menos oito horas a quatro graus Celsius.
Transfira para um litro de tampão de diálise dois e mexa a tubulação e seu conteúdo em uma agitação magnética por pelo menos oito horas a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira para um litro de tampão de diálise três e mexa o tubo e seu conteúdo em uma agitação magnética por nada menos que oito horas a quatro graus Celsius. Transfira a amostra para um recipiente apropriado e rotule-as como MMP discada.
Examine o tubo para precipitar. Por uma alíquota mililitro de um miligrama por mililitro MMP, adicione 50 microliters de 20 mililitros APMA para alcançar uma concentração final de APMA de um mililitro. Se um precipitado se formar, centrifuse-o em velocidade máxima por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Armazene o supernatante em um tubo de microfuge de 1,5 mililitro rotulado MMP ativado. Descarte o precipitado em um recipiente marcado para resíduos de APMA. O SDS-PAGE foi executado para comparar as frações de elução de purificação de sua tag do domínio catalítico Pro MMP-3 de células BL21 DE3 em células R2DP.
As primeiras oito frações de elução do domínio catalítico MMP e células BL21 DE3 mostraram proteína menor do que as do domínio catalítico MMP marcado em células R2DP. As frações induzidas, redobradas, concentradas, ativadas e desseladas de células MMP3 CD e R2DP são mostradas. Após a ativação, o peso molecular da banda de CD MMP-3 ativada é de aproximadamente 20 kilodaltons, ao contrário do zymogen sua marcado que permanece em cerca de 30 kilodaltons.
Quando as células centrifugadoras lises, as pelotas podem não ser compactas. Quando isso ocorre, sonicar mais e centrifugar por mais tempo. Ao reconcentrar a proteína, pode ocorrer precipitação.
Dissolva-o no tampão de solubilização e repita o processo. O procedimento descrito aqui fornece um método detalhado para a expressão solúvel de MMPs humanos ativos que podem eventualmente ser usados para entender o mecanismo molecular da atividade enzimática MMP. Métodos alternativos de purificação de proteínas, como o FPLC, podem ser realizados em proteínas MMP purificadas.
