מתודולוגיה זו משמעותית בכך שהיא מאפשרת שיטה ניתנת לשחזור ומדויקת לכימות מוצרי תרופות המיושמים באופן מקומי באמצעות הדמיית ראמאן קוהרנטית. מתודולוגיות אחרות מספקות מידע פרמקוקינטי עורי מגושם, בעוד שמתודולוגיה זו יכולה לספק הן מידע פרמקוקינטי עורי בתפזורת והן בקנה מידה זעיר כגון מסלול החדירה של תרופה. מסלולי ההדמיה והכימות והחלחול יאפשרו פיתוח של מוצרי תרופות מתוך מחשבה על מסלול מסוים כדי להגיע לאתר היעד.
הכנת רקמות תתברר כחלק המאתגר ביותר במתודולוגיה זו. הרקמה צריכה להיות דקה מספיק כדי שאדם יוכל לקרוא דרך העור. כדי להתחיל את ההכנה של רקמת עור אוזן עכבר עירום עירום, לרכוש עכברים עירומים המתים ולהסיר את האוזניים של העכבר באמצעות מלקחיים ומספריים microsurgical.
לאחר מכן הניחו אוזן אחת בצלחת פטרי גדולה בגודל 60 מילימטרים על 15 מילימטרים. לאחר מכן, שטפו פעמיים את אוזן העכבר עם PBS וטפחו על האוזן בכל פעם עם מגב המשימה. אם נעשה שימוש תוך 24 שעות, הניחו את האוזן ב-PBS בצלחת פטרי קטנה בגודל 35 מילימטרים על 10 מילימטרים בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.
כדי להשתמש לאחר 24 שעות של קציר, מניחים את האוזן בצלחת פטרי ללא PBS, ואז מכסים את המנה בפרפילם כדי לאחסן במקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס. תוך כדי עבודה מתחת למכסה המנוע הביולוגי, מניחים את רקמת העור האנושית בצלחת פטרי גדולה כשצד הקרנית השכבתי פונה כלפי מטה, כך שהשומן התת עורי יהיה נגיש. לאחר מכן השתמש במלקחיים ומספריים מיקרו-כירורגיים כדי להסיר את השומן התת עורי.
ברגע שלא ניתן עוד להסיר שומן תת עורי עם המספריים, השתמש באזמל חד פעמי של 10 להבים בזווית של 45 מעלות לעור כדי להסיר את השומן התת עורי הנותר תוך החזקת העור עדיין עם מלקחיים. כאשר השומן מוסר, חתכו את עור האדם לסנטימטר אחד על סנטימטר אחד חתיכות. להדמיית שומנים, הניחו את החלק הקדמי של אוזן העכבר הפונה לכיוון קרקעית הזכוכית של צלחת בגודל 35 מילימטר, מספר אפס.
עבור העור האנושי, הניחו את העור עם שכבת הקרנית הפונה כלפי מטה כדי לאפשר כימות סמים מהשטחי לשכבות העמוקות יותר. לאחר שהרקמה התרכזה בתחתית הזכוכית, השתמשו במוליך קצה הכותנה כדי לוודא שהעור שטוח ויש לו מגע מלא עם משטח החלקת הכיסוי של צלחת הזכוכית התחתונה. כדי למנוע כל תנועה בזמן ההדמיה, הניחו מכונת כביסה על גבי העור וודאו שהרקמה נראית דרך החור המרכזי של מכונת הכביסה לצורך פיזור ראמן מגורה או זיהוי שידור SRS.
פיפטה את המינון שנקבע מראש של הפורמולה על העור, ואז השתמש באצבע עם כפפות כדי לשפשף את הפורמולה בכיוון השעון למשך 30 שניות. לאחר שחלף הזמן המוקצב לפורמולה לחלחל, יש להסיר את הפורמולה העודפת לפני הנחת העור כשצד הפורמולציה פונה לכיוון המנה התחתונה של הזכוכית. לאחר מכן, המשך למערך הניסוי על ידי הפעלת מיקרוסקופ בקרה או תוכנת MC.
במבט דרך העינית, התאימו את המיקוד הצירי בידית ההתאמה כדי לוודא שהרקמה נמצאת בפוקוס. בסיום, בטל את החסימה הן של המשאבה והן של אלומות סטוקס וודא כי ערוצי ALG1 ו- ALG2 מופעלים. ודא שהפוטודיודה של SRS ממוקמת מעל המעבה, ולאחר מכן לחץ על Focus x2 בתוכנת MC כדי להמחיש את העור בערוצי CARS ו- SRS.
במודול הקפאת זמן מרובת אזורים או MATL, עבור אל הכרטיסיה תצוגה ולחץ על רשימת הנקודות הרשומות כדי שרשימת ההדמיה תופיע. לאחר זיהוי שכבת הקרנית, גלול דרך המיקוד הצירי או ממוקד Z כדי לזהות ריבוד רקמות ספציפיות. ניתן להוסיף עומקים ספציפיים בתוך העור כגון שכבת קרנית, בלוטות החלב, אדיפוציטים או שומן תת עורי, כפי שנקבע במהלך הדמיה חיה עם ניגודיות מכוונת שומנים.
עם זאת, אם יש לקחת ערימות עומק שלמות, ניתן להוסיף מיקומי XY, וניתן להתעלם ממיקום ה-Z היחסי. במקרה של הדמיה של עומק ספציפי עבור כל ריבוד עור, בחר את נקודת הרישום כדי להוסיף אותה לתור MATL. לקבלת ערימות עומק מלאות, לחץ על נקודת רישום עבור כל מיקום XY עם בחירת עומק בחלון פרמטרי הרכישה.
לאחר מכן, הגדר את מספר החזרות לאחד במודול MATL ולחץ על מוכן. כאשר החץ 'הפעל' משתנה מאפור לשחור, לחץ על Play כדי להתחיל לדמיין את ערימת השומנים הראשונית. לאחר השלמת מחזור ההדמיה, לחסום הן את המשאבה והן את אלומות סטוקס ולשנות את אורך הגל בממשק המשתמש הגרפי של הלייזר לאורך הגל הרצוי בהתבסס על מספר הגל הממוקד או רטט ראמאן.
התאם את שלב השהיית הזמן הידני תוך הקפדה על כך שאותם כוחות משמשים כדי לדמות את השומנים ואת החומר התרופתי הפעיל או ה- API אשר הוקמו מראש. לאחר בחירת המספר הכולל של מחזורים חוזרים, בטל את החסימה של קרן המשאבה ובדוק אם ההספק תואם את ההספק הרצוי באמצעות הפוטודיודה לפני שתלחץ על Play כדי להתחיל בהדמיה אוטומטית של הנקודות המוגדרות. לאחר מכן, בצע ניתוח נתונים עבור כל ריבוד עור על ידי ייבוא תמונת שומנים של בלוטת החלב לתוך פיג'י וסימון התיבה שכותרתה ערוצי Split כדי לפצל את הקובץ לערוצי CARS ו- SRS.
כדי לפתוח את אזור העניין או מנהל ההחזר על ההשקעה, לחץ על ניתוח, כלים ומנהל החזר ההשקעה. באמצעות שימוש בערוץ SRS כך ש- C שווה לאחד, בטל את הסימון של בלוטת החלב בתמונה והוסף את הסימונים למנהל ההחזר על ההשקעה על ידי לחיצה על הוסף T במנהל ההחזר על ההשקעה. חזור על התהליך עבור כל בלוטת חלב בתוך התמונה.
כדי להסוות את האזורים העשירים בשומנים, בחרו בכל החזר השקעה ולאחר מכן לחצו על כרטיסיות 'עוד', 'או שילוב' ו'הוסף'. כדי להסוות את האזורים העניים בשומנים, השתמשו בכלי המלבן בתפריט פיג'י וציירו ריבוע סביב התמונה כולה. הוסף את האזור למנהל ההחזר על ההשקעה.
לחץ על החזר ההשקעה המרובע החדש שנוסף בנוסף להחזר ההשקעה שבוחר את כל האזורים העשירים בשומנים במנהל ההחזר על ההשקעה. תחת עוד, בחר XOR כדי ליצור מסכה של האזורים העניים בשומנים והוסף אותה למנהל ההחזר על ההשקעה. שרשור את התמונות בסדר מספרי על-ידי מעבר לכרטיסיות 'תמונה', 'ערימות', 'כלים' ו'שרשור' לפי הסדר.
לחלופין, יבא את התמונות על-ידי טעינת אחת מהן לתוך פיג'י ולאחר מכן בחירת אפשרות בשם Group files עם שמות דומים בדף ההתקנה. בזמן שהתמונה המשורשרת פעילה, עבור אל מנהל ההחזר על ההשקעה כדי לבחור את האזורים העשירים בשומנים וללחוץ על הכרטיסיה עוד לפני שתבחר במדד רב, ולאחר מכן המתן עד שיופיע חלון התוצאות. מהחלון תוצאות, ייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני והוסף עמודה שכותרתה אזור כדי להוסיף אזורים עשירים בשומנים לכל שורת נתונים.
הוסיפו ליפידים עניים לאזורים שהיו מחוץ לשומנים. כדי להציג את הנתונים באופן חזותי, שמור ויבא את הגיליון האלקטרוני לחבילת R, ggplot2. לאחר מכן התווה את הנתונים כפונקציה של מספר התמונה לעומת העוצמה הממוצעת כדי להעריך את נתוני זמן הריכוז.
הפעל ניתוח לא-ממודר או NCA ב- RStudio על נתוני זמן העוצמה המיובאים מהגיליון האלקטרוני עם הקריאה לשכבה אחת. בסיום, יש להתוות ולהשוות חזותית בין מדדי Jmax ו-AUCflux-all. בנוסף, בצע השוואות סטטיסטיות בין תנאי ניסוי.
הניתוח הייצוגי מתאר שכבת קרנית, בלוטות החלב, אדיפוציטים, שומן תת עורי מעור האוזן של העכבר העירום, וקורניום שכבתי, דרמיס פפילרי ובלוטת חלב מעור האדם. בעור אוזן עכבר עירום, תנועת הרקמה המוגבלת של בלוטות החלב נצפתה עם אותו עומק רקמה של הבלוטות בזמן יישום הפורמולציה ו -120 דקות לאחר המריחה. תנועת הרקמה המשמעותית בעור הראתה בלוטות החלב שבקושי נראות לעין לאחר 120 דקות של שימוש בתרופה, מה שהדגים את חוסר היעילות של הפרוטוקול המקורי.
במספר מחקרים, פרופילי העוצמה לעומת הזמן הראו ריכוזים ראשוניים גבוהים, ולאחר מכן ירידה בריכוזים, מה שמעיד על היעדר ספיגה נוספת של התרופה לתוך הרקמה. מצד שני, חלק מהמחקרים הצביעו על עלייה בעוצמות שירדו מאוחר יותר במהלך תקופת הניסוי, והוכיחו כי השטף לתוך הרקמה לא הגיע למקסימום לפני ההדמיה. ניתוח NCA של פרופילי זמן ריכוז של שני פורמולציות עבור אותו API הצביע על כך שהאתוקסי-אתוקסיאתנול סיפק חדירת API מורחבת בהשוואה לזו של נוסחת הג'ל ללא קשר לשכבת העור.
ניתוח החשיפה הכולל בין אותם ניסוחים הציג תצפיות דומות בשכבות העמוקות יותר של העור. הכנת עור האדם ומיקום עור נכון על צלחת הזכוכית התחתונה לאחר מריחת התרופה הם קריטיים להצלחת הניסוי. הפתרונות הברורים כאן הדגימו את התאמתה של מתודולוגיה זו.
מחקר נוסף יכלול פורמולציות משווקות כגון קרמים כדי להבין כיצד הפורמולציה משפיעה על חדירת API וחדירה.
