היי, אני ד"ר סעיד שאדאב רזא, החוקר הראשי של המעבדה לתאי גזע ונוירולוגיה משקמת, הממוקמת במחלקה לביוטכנולוגיה בקמפוס אוניברסיטת עידן, לאקנאו, הודו. במעבדה שלי, אנו שואפים להבין את המנגנון הפתופיזיולוגי שבבסיס הפרעות איסכמיה-רפרופסיה ואת ההתערבויות שיכולות להפוך תהליכים אלה. בהקשר זה, אנו מעסיקים לעתים קרובות את ההפריה המו ויטרו ואת מודל in vivo של שבץ איסכמי.
לאחרונה, יצרנו מודל לפציעה איסכמית-רפרפוזיה בשלושה ימים בפיתוח עובר אפרוח. אז עכשיו התלמידים שלי יראו לכם איך לשכפל את הפציעה של איסכמיה-רפרופוזיה בעובר אפרוח מתפתח של שלושה ימים. עכשיו אנחנו הולכים להראות לכם איך ליצור איסכמיה-רפרפוזיה בעובר אפרוח של שלושה ימים.
המודל שלנו חסכוני, יעיל בזמן ושחזורי מאוד. אז בואו נתחיל. היום הראשון.
דרישות ליום הראשון. פרוצדורה. נקו את ביצת האפס יום עם 70% אתנול באמצעות מגבונים מנייר טישו. לאחר מכן, לכתוב את היום הנוכחי, תאריך, על ביצים עם סמן OHP ולאחר מכן למקם את הביצים באינקובטור ביצה עם טמפרטורה של 36 עד 37 מעלות צלזיוס ו 60 עד 65% לחות.
לדגור על הביצים במשך 24 השעות הבאות. היום השני. דרישות ליום השני. פרוצדורה.
נגב את המספריים הניתוחיים עם 70% אתנול או ואחריו אוטוקלבה. לאחר 24 שעות של דגירה, להסיר את הביצה מתוך האינקובטור עבור שכבות. לאחר מכן, לצרף חתיכה קטנה של Sellotape כ אורך ורוחב של סנטימטר אחד לקצה הביצה ולאחר מכן לעשות חור קטן בקצה קליפת הביצה באמצעות מספרי קצה מחודד חד ואחריו החדרת מזרק חמישה מ"ל בזווית של כ 75 מעלות.
לאחר החדרת המחט לתוך שק החלמון, לאט למשוך חמישה עד שישה מ"ל של אלבומין. לאחר הסרת האלבום, חסן מחדש את החור עם Sellotape והחזיר את הביצה לתוך 37 מעלות צלזיוס ביצה אינקובטור במשך 48 השעות הבאות. היום הרביעי.
דרישות ליום הרביעי. פרוצדורה. הכן את תמיסת הצלצול, 0.9% תמיסת מלח רגילה ותמיסת מלח חיץ X פוספט אחת לפי הטבלאות המופיעות בכתב יד זה. לאחר מכן תבודדו אוטומטית את שלושת הפתרונות.
לאחר autoclave, הפתרונות המתאימים עשויים להיות ממוקמים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוציא את הביצה מן אינקובטור ביצה 37 מעלות. עכשיו, לפני חיתוך הקליפה, לכסות את האזור של חלונות עם Sellotape.
ועכשיו לעשות חור קטן על קליפת הביצה ולהתחיל לחתוך פתח מעגלי. תהליך זה נקרא חלון. ודא כי החתך המעגלי הוא גדול מספיק, כך העובר יכול בקלות להיות נגיש מכל כיוון, כמו המיקום של הביצה ייתכן שיהיה צורך להתאים לפי המיקום של העובר.
עכשיו, באמצעות מיקרוסקופ כירורגי זום סטריאו, לאתר את העורק החיוני הנכון או RVA. כאן, החץ מציין את השלב ההתפתחותי בן שלושת הימים של העובר. לאחר RVA ממוקם, עם השימוש מחט 26 G לעשות שני חורים קטנים בצד שמאל וימין של RVA.
לאחר מכן, להתאים את בדיקת הדמיית זרימת הדם דופלר על RVA. יש למקם את בדיקת הדמיית זרימת הדם דופלר חמישה פלוס מינוס מילימטר אחד מאתר איסכמיה ושני שלישים מהקצה הדיסטלי של ה- RVA. קח קריאת שטף במשך 30 שניות עד שתי דקות, לפי הצורך.
זה יגרום לקריאת שלב הנורמוקסיה. עכשיו לעצב באופן ידני את קצה מחט עמוד השדרה כדי לתת לקצה צורה של וו בעזרת צבת האף ואחריו מלקחיים שיניים. עכשיו, באמצעות מיקרו מניפולטור, להכניס את מחט עמוד השדרה ממש מתחת לעורק החיוני הנכון.
אתה מוכן להרים את מחט עמוד השדרה. עכשיו בסיועו של מניפולטור מיקרו, לאט להרים את העורק עד שטף זרימת הדם דופלר מראה ירידה מינימלית של 80% בזרימת העורקים. לאחר ירידה של 80% או יותר בשטף דופלר מושגת, להשאיר את מחט עמוד השדרה הרים כלפי מעלה, מושך את העורק במשך חמש דקות.
זו תהיה תקופת איסכמיה. לאחר תזמון איסכמי זה של חמש דקות, לאט לשחרר את העורק בעזרת מיקרו מניפולטור כדי לשחזר את רמות זרימת הדם נורמלית. עכשיו מד זרימת הדם דופלר צריך להראות קריאות דומות לאלה שנצפו במהלך נורמוקסיה.
זו תהיה תקופת הרפרפוזיה ב- RVA. לאחר תהליך ה- I/R, יש למרוח שתיים, שלוש טיפות של PBS 1X על העובר. לבסוף, לסגת מחדש את החלון עם Sellotape ולאחר מכן למקם את הביצה בחזרה בחממת הביצים במשך חמש שעות ו 55 דקות.
לאחר חמש שעות ו -55 דקות, להוציא את הביצה מן אינקובטור הביצה ומניחים על מגש הביצים ולפתוח מחדש את החלון. דרישות הטיפול. פרוצדורה. לטיפול בעורקים עם התרופות, המפעילים או המעכבים, יש לחתוך את ה- RVA לאחר שעה אחת של תהליך I/R.
מוציאים את העובר מהקליפה על ידי הוצאתו מהקליפה לצלחת פטרי סטרילית של 100 מ"מ. לאחר העובר משתחרר בצלחת פטרי, excise את RVA באמצעות קשתית העין בהנחיית מיקרוסקופ כירורגי זום סטריאו. ממד כריתת הצואה של RVA צריך להיות עד 15 פלוס מינוס דיסטלי מילימטר אחד מתא המטען ושניים פלוס מינוס מילימטר אחד לכיוון תא המטען.
לאחר כריתת RVA, לשטוף אותו עם 1X PBS בצלחת פטרי חדשה, סטרילי. לטיפולים הרצויים, יש לשים את העורק בצינור צנטריפוגה מעוקר של 1.5 מיליליטר מלא ב-500 מיקרוליטרים של הפתרון של רינגר. ואחרי הנחת העורק בצינור הצנטריפוגה, הכניסו לאינקובטור המעבדה הצנטריגרדי 37 מעלות במשך חמש שעות.
לאחר חמש שעות של דגירה, להוציא את RVA מן החממה מעבדה Centigrade 37 מעלות ולהמשיך לטיפולים הרצויים. ועכשיו, כדי להציג את התוצאות. כדי לאמת את התועלת של המודל שלנו במחקר איסכמי-reperfusion בעורקים איסכמיים, תחילה הסתכלנו על הפעילות של חלבונים רגולטוריים חמצן 150 או ORP150, ציטופלסמוס סופראוקסיד dismutase אחד או SOD1 וקטלסה.
RVAs שטופלו ב- I/R הראו פעילות מוגברת של ORP150, SOD1 ציטופלסמי וקטלאז בהשוואה לקבוצת הביקורת, עם זאת, שכשהם עם N-אצטיל-L-ציסטאין, או NAC, ROS quencher, הפחתת סטרס חמצוני בקבוצת I /R, כפי שניתן לראות באיור הנוכחי. כדי לבסס את כלי השירות של מודל זה עבור חקירות דלקתיות, בדקנו את הביטוי של I /R-1 בטא ו- TNF-אלפא ב- RVAs שטופלו ב- I /R לעומת RVAs בקרה. שני האינטרלוקים נמצאו מבוטאים יתר על המידה בקבוצת הוק-I/R בהשוואה לקבוצת הביקורת.
תוספי Naringenin, תרופה אנטי דלקתית, הפחית באופן משמעותי את רמות IL1-בטא, כמו גם TNF-אלפא. לאחר מכן, בדקנו את הביטוי של NLRP3 ו- NF-kappa beta באמצעות סופג מערבי. ניתוח זה גילה ראיות להפעלה של NLRP3 מודלק, כמו גם NF-kappa בטא בתגובה I / R המיוצר RVA.
בדומה לתוצאות קודמות, Naringenin הפחית את הביטוי של NLRP3 ו- NF-kappa בטא. תוצאות אלה הראו כי המודל שלנו יכול לשמש כדי לחקור שינויים דלקתיים. לאחר מכן, בדקנו את ההשפעה של I/R על אפופטוזיס ומסלולים autophagy.
ראשית, באיור א', ניגשנו לביטוי של קספאזה-3. ראינו ביטוי משופר של caspase-3 מחשוף בקבוצת קלט/פלט בהשוואה לקבוצת הביקורת, בעוד שקבוצת הקלט/R שקיבלה ZVADFMK הראתה ירידה בביטוי של caspase-3. באופן דומה עבור autophagy, קבוצת I/R הציג רמות חלבון גבוהות של LC3, סמן autophagosome Beclin-1, רגולטור מפתח של אוטופגיה בתאי יונקים, ו ATG-7, חלבון הנדרש עבור autophagy בסיס, מאשר קבוצת הביקורת, בעוד הקבוצות המקבלות 3-ma, מעכב autophagy, הראו ירידה בביטוי של שלושת חלבונים autophagy לעיל, כפי שניתן לראות מהנתונים B עד D.הדמות E מדגימה את ההשפעה של I/R בתיווך הוק על רמות ambra-1 ו- ATG-7 mRNA.
תוצאות אלה היו בקנה אחד עם התוצאות הקודמות, כלומר, ביטוי mRNA משופר נצפתה עבור ambra-1 ו ATG-7 ב RVAs שטופלו ב- I/R בהשוואה לפקדים המתאימים שלהם. עם זאת, התוצאות היו הפוכות כאשר 3-ma נוסף לקבוצת I /R. הדמות הנוכחית מייצגת את האפקטיביות של המודל שלנו ללמוד את השינויים בדנ"א.
ראינו מריחת דנ"א אינטנסיבית בקבוצה שטופלו ב- I /R בהשוואה לקבוצת הביקורת. עם זאת, התוספת של NAC לקבוצת I/RVA הפכה את התוצאה. כדי לבחון עד כמה המודל שלנו יעיל בניגוד למודלים אחרים, השווינו את הנתונים שנוצרו על ידי מודל Hook-I/R שלנו ומודל MCAO בניסוי הנוכחי.
לתקציר, הביטוי של חלבון אפופטוטי, caspase-3 מחשוף, חלבונים autophagy, Beclin-1 ו ATG-7, ואת interleukins דלקתי, TNF ו- IFN, היה חייב להיות גבוה יותר בקרוואנים שטופלו ב- I / R מאשר בקרוואנים בקרה. מעניין, מודל Hook-I/R נתן תוצאות דומות מאוד לאלה שהושגו על ידי מודל MCAO, בין אם זה היה ניתוח עבור מתח דלקתי או מסלולי מוות תאי. המודל שלנו יכול לשמש לניסויים שגרתיים של איסכמיה-רפרופוזיה, לבד או במקביל למודלים הקיימים.
עם זאת, במהלך חיקוי איסכמיה-reperfusion, אמצעי זהירות הגבוה ביותר יש לנקוט במהלך ביצוע חורים, בצד ימין ושמאל של RVA, וגם תוך איסור או שחרור RVA, כך שזה לא צריך לפגוע כל עורקים או ורידים. בביולוגיה מולקולרית שגרתית כגון סופג מערבי, מנתח QRT-PCR, חומצות כימיות וטכניקות הדמיה ניתן לאלתר כדי לקשר פתופיזיולוגיה הקשורים איסכמיה-reperfusion בשלושה ימים פיתוח עובר אפרוח. מודל זה יכול לשמש ביעילות לחקר מכניקה מולקולרית ברמות DNA, RNA וחלבון.
כפי שהראינו לכם, דוגמנות I/R בשלושה ימים בפיתוח עוברים אפרוחים, אנו מאמינים כי המודל שלנו יפתח אפיקים חדשים בתחום מחקר I/R. עם העבודה הזאת, אני מאחל לך כל טוב לניסויים שלך. תודה.
