Ciao, sono il Dr.Syed Shadab Raza, il ricercatore principale per il Laboratorio di Cellule Staminali e Neurologia Restaurativa, situato presso il Dipartimento di Biotecnologie presso l'Era University Campus, Lucknow, India. Nel mio laboratorio, ci sforziamo di comprendere il meccanismo fisiopatologico alla base dei disturbi ischemia-riperfusione e gli interventi che possono invertire tali processi. In questo contesto, impieghiamo frequentemente il modello in vitro e in vivo dell'ictus ischemico.
Recentemente, abbiamo creato un modello di lesione da riperfusione ischemica in un embrione di pulcino in via di sviluppo di tre giorni. Quindi ora i miei studenti ti mostreranno come replicare la lesione da ischemia-riperfusione in un embrione di pulcino in via di sviluppo di tre giorni. Ora ti mostreremo come creare ischemia-riperfusione in un embrione di pulcino di tre giorni.
Il nostro modello è economico, efficace in termini di tempo e altamente riproducibile. Quindi iniziamo. Primo giorno.
Requisiti per il primo giorno. Procedimento. Pulire l'uovo zero day con etanolo al 70% usando salviette di carta velina. Quindi, scrivi il giorno corrente, la data, sulle uova con il marcatore OHP e quindi posiziona le uova in un'incubatrice per uova con una temperatura da 36 a 37 gradi centigradi e dal 60 al 65% di umidità.
Incubare le uova per le prossime 24 ore. Secondo giorno. Requisiti per il secondo giorno. Procedimento.
Pulire la forbice chirurgica con etanolo al 70% o seguita da un'autoclave. Dopo 24 ore di incubazione, rimuovere l'uovo dall'incubatrice per la stratificazione. Quindi, attaccare un piccolo pezzo di Sellotape di circa un pollice di lunghezza e larghezza al bordo dell'uovo e quindi fare un piccolo foro nel bordo del guscio d'uovo usando la forbice a punta affilata seguita dall'inserimento di una siringa da cinque ml con un angolo di circa 75 gradi.
Dopo aver inserito l'ago nel sacco del tuorlo, prelevare lentamente da cinque a sei ml di albumina. Dopo aver rimosso l'albumina, risigillare il buco con Sellotape e rimettere l'uovo nell'incubatrice per uova centigrada a 37 gradi per le prossime 48 ore. Quarto giorno.
Requisiti per il quarto giorno. Procedimento. Preparare la soluzione di Ringer, soluzione salina normale allo 0,9% e una soluzione salina tampone X fosfato secondo le tabelle fornite in questo manoscritto. Quindi autoclave le tre soluzioni.
Dopo l'autoclave, le rispettive soluzioni possono essere posizionate a temperatura ambiente. Quindi, estrarre l'uovo dall'incubatrice a 37 gradi. Ora, prima di tagliare il guscio, coprire l'area di finestratura con Sellotape.
E ora fai un piccolo foro sul guscio d'uovo e inizia a tagliare un'apertura circolare. Questo processo è noto come windowing. Assicurati che il taglio circolare sia abbastanza grande in modo che l'embrione possa essere facilmente accessibile da qualsiasi direzione, poiché il posizionamento dell'uovo potrebbe dover essere regolato in base alla posizione dell'embrione.
Ora, utilizzando un microscopio chirurgico con zoom stereo, individuare l'arteria vitale destra o RVA. Qui, la freccia indica lo stadio di sviluppo di tre giorni dell'embrione. Una volta individuato l'RVA, con l'uso di un ago da 26 G fare due piccoli fori sui lati sinistro e destro dell'RVA.
Quindi, regolare la sonda di imaging del flusso sanguigno Doppler sull'RVA. La sonda doppler per l'imaging del flusso sanguigno deve essere posizionata cinque più meno un millimetro dal sito di ischemia e due terzi dall'estremità distale dell'RVA. Prendere la lettura del flusso per 30 secondi a due minuti, come desiderato.
Questo renderà la lettura della fase normossia. Ora modella manualmente il bordo dell'ago spinale per dare al bordo una forma di gancio con l'aiuto di una pinza per il naso seguita da una pinza per i denti. Ora, usando un micropolatore, inserisci l'ago spinale appena sotto l'arteria vitale destra.
Sei pronto a sollevare l'ago spinale. Ora, con l'assistenza del micropolatore, sollevare lentamente l'arteria fino a quando il flusso sanguigno Doppler mostra una diminuzione minima dell'80% del flusso arterioso. Una volta raggiunto un dropdown dell'80% o più nel flusso Doppler, lasciare l'ago spinale sollevato verso l'alto, tirando l'arteria per cinque minuti.
Questo sarà il periodo di ischemia. Dopo questo tempismo ischemico di cinque minuti, rilasciare lentamente l'arteria con l'aiuto del micropolatore per ripristinare i normali livelli di flusso sanguigno. Ora il misuratore di flusso sanguigno Doppler dovrebbe mostrare letture simili a quelle osservate durante la normossia.
Questo sarà il periodo di riperfusione nell'RVA. Dopo il processo I/R, applicare due, tre gocce di 1X PBS all'embrione. Infine, risigillare la finestra con Sellotape e quindi rimettere l'uovo nell'incubatrice per cinque ore e 55 minuti.
Dopo cinque ore e 55 minuti, estrarre l'uovo dall'incubatrice e posizionarlo sul vassoio delle uova e riaprire la finestra. Requisiti di trattamento. Procedimento. Per il trattamento delle arterie con farmaci, attivatori o inibitori, l'RVA deve essere asportato dopo un'ora di processo I / R.
Rimuovere l'embrione dal guscio estraendolo dal guscio su una capsula di Petri sterile da 100 mm. Una volta che l'embrione viene rilasciato nella capsula di Petri, asportare l'RVA usando l'iride oculare nella guida del microscopio chirurgico stereo zoom. La dimensione di escissione di RVA dovrebbe essere fino a 15 più meno un millimetro distale dal tronco e due più meno un millimetro verso il tronco.
Dopo aver asportato l'RVA, lavarlo con 1X PBS in una nuova capsula di Petri sterile. Per i trattamenti desiderati, mettere l'arteria in un tubo centrifugo sterilizzato da 1,5 millilitri riempito con 500 microlitri della soluzione di Ringer. E dopo aver posizionato l'arteria nel tubo della centrifuga, mettere nell'incubatore di laboratorio a 37 gradi centigradi per cinque ore.
Dopo cinque ore di incubazione, estrarre l'RVA dall'incubatore di laboratorio a 37 gradi centigradi e procedere per i trattamenti desiderati. E ora, per presentare i risultati. Per verificare l'utilità del nostro modello nella ricerca ischemico-riperfusionale nelle arterie ischemiche, abbiamo prima esaminato le attività delle proteine regolatrici dell'ossigeno 150 o ORP150, della superossido dismutasi citoplasmatica uno o della SOD1 e della catalasi.
Gli VA trattati con I/R hanno mostrato un aumento dell'attività di ORP150, SOD1 citoplasmatica e catalasi rispetto al gruppo di controllo, tuttavia, integrando con N-acetil-L-cisteina, o NAC, un quencher ROS, ha ridotto lo stress ossidativo nel gruppo I/ R, come può essere evidente nella figura attuale. Per stabilire l'utilità di questo modello per le indagini infiammatorie, abbiamo esaminato l'espressione di I/R-1 beta e TNF-alfa negli ARRA trattati con I/R rispetto ai VA di controllo. Entrambe le interleuchine sono risultate sovra-espresse nel gruppo Hook-I/R rispetto al gruppo di controllo.
L'integrazione di Naringenina, un farmaco antinfiammatorio, ha ridotto significativamente i livelli di IL1-beta e TNF-alfa. Successivamente, abbiamo esaminato l'espressione di NLRP3 e NF-kappa beta attraverso il Western blotting. Questa analisi ha scoperto prove di attivazione dell'inflamasoma NLRP3, così come NF-kappa beta in risposta all'I/R prodotto nell'RVA.
Analogamente ai risultati precedenti, Naringenin ha ridotto l'espressione di NLRP3 e NF-kappa beta. Questi risultati hanno dimostrato che il nostro modello potrebbe essere utilizzato per studiare le alterazioni infiammatorie. Successivamente, abbiamo esaminato l'effetto di I / R sulle vie di apoptosi e autofagia.
Innanzitutto, nella figura A, abbiamo avuto accesso all'espressione di caspasi-3 scissa. Abbiamo osservato una maggiore espressione di caspasi-3 scissa nel gruppo I/R rispetto al gruppo di controllo, mentre il gruppo I/R che riceveva ZVADFMK ha mostrato una diminuzione dell'espressione di caspasi-3. Analogamente per l'autofagia, il gruppo I/R ha mostrato alti livelli proteici di LC3, marcatore dell'autofagosoma Beclin-1, un regolatore chiave dell'autofagia nelle cellule di mammifero, e ATG-7, una proteina necessaria per l'autofagia basale, rispetto al gruppo di controllo, mentre i gruppi che hanno ricevuto 3-ma, un inibitore dell'autofagia, hanno mostrato una diminuzione dell'espressione delle tre proteine dell'autofagia di cui sopra, come evidente dalle figure da B a D.La figura E dimostra l'effetto dell'I/R mediato da Hook sui livelli di mRNA ambra-1 e ATG-7.
Questi risultati erano in linea con i risultati precedenti, cioè è stata osservata una maggiore espressione di mRNA per ambra-1 e ATG-7 negli ARRA trattati con I/R rispetto ai rispettivi controlli. Tuttavia, i risultati sono stati invertiti quando 3-ma è stato aggiunto al gruppo I / R. La cifra attuale rappresenta l'efficacia del nostro modello per studiare le alterazioni nel DNA.
Abbiamo osservato un intenso striscio di DNA nel gruppo trattato con I / R rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, l'integrazione di NAC al gruppo I/R RVA ha invertito il risultato. Per esaminare l'efficacia del nostro modello rispetto ad altri modelli, abbiamo confrontato i dati generati dal nostro modello Hook-I/R e dal modello MCAO nel presente esperimento.
In breve, l'espressione della proteina apoptotica, la caspasi-3 scissa, le proteine dell'autofagia, Beclin-1 e ATG-7, e le interleuchine infiammatorie, TNF e IFN, era destinata ad essere più alta negli RVA trattati con I / R rispetto agli RVA di controllo. È interessante notare che il modello Hook-I / R ha dato risultati molto simili a quelli ottenuti dal modello MCAO, sia che si trattasse dell'analisi per lo stress infiammatorio o delle vie di morte cellulare. Il nostro modello può essere utilizzato per esperimenti di routine di ischemia-riperfusione, da solo o parallelamente ai modelli esistenti.
Tuttavia, durante l'imitazione dell'ischemia-riperfusione, è necessario prendere la massima precauzione durante la perforazione, il lato destro e sinistro dell'RVA, e anche durante l'occlusione o il rilascio dell'RVA in modo che non danneggi le arterie o le vene. Nella biologia molecolare di routine come il Western blotting, l'analizzatore QRT-PCR, gli acidi chimici e le tecniche di imaging potrebbero essere improvvisati per associare la fisiopatologia associata all'ischemia-riperfusione in un embrione di pulcino in via di sviluppo di tre giorni. Questo modello potrebbe essere utilizzato in modo efficiente per studiare la meccanica molecolare a livello di DNA, RNA e proteine.
Come vi abbiamo mostrato, la modellazione I/R in un embrione di pulcino in via di sviluppo di tre giorni, crediamo che il nostro modello aprirà nuove strade nel campo della ricerca I/R. Con questo lavoro, vi auguro tutto il meglio per i vostri esperimenti. Grazie.
