안녕하세요, 저는 인도 의 에라 대학 캠퍼스의 생명 공학 부에 위치한 줄기 세포 및 회복 신경학 연구소의 수석 연구원인 Syed Shadab Raza 박사입니다. 내 실험실에서, 우리는 허혈 재관 전 질환과 그 과정을 반전 할 수있는 내정간섭의 근본적인 병리학 적 메커니즘을 이해하기 위해 노력하고 있습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 종종 시험관 내 및 허혈성 뇌졸중의 생체 내 모델을 사용합니다.
최근에는 병아리 배아를 개발하는 3일 동안 허혈성 재관성 부상 모델을 만들었습니다. 그래서 지금 내 학생들은 병아리 배아를 개발 3 일에 허혈 -reperfusion 부상을 복제하는 방법을 보여 줄 것입니다. 이제 우리는 3 일 병아리 배아에서 허혈 재관전을 만드는 방법을 보여 줄 것입니다.
우리의 모델은 비용 효율적이고 시간 효율적이며 매우 재현 할 수 있습니다. 그래서 시작하자. 첫날.
첫날에 대한 요구 사항. 절차. 티슈 페이퍼 와이프를 사용하여 70 %의 에탄올로 제로 데이 계란을 청소하십시오. 다음으로, 현재 날짜, 날짜를 OHP 마커가 있는 계란에 적힌 다음, 36~37도의 온도와 60~65%의 습도로 달걀인 인큐베이터에 놓습니다.
다음 24 시간 동안 계란을 배양. 둘째 날. 둘째 날에 대한 요구 사항. 절차.
70%에탄올로 수술 용 가위를 닦거나 오토클레이브가 뒤따릅니다. 24시간 동안 인큐베이션을 한 후, 배양을 위해 인큐베이터에서 계란을 제거합니다. 다음으로, 살로테이프의 작은 조각을 달걀 가장자리에 약 1인치 길이와 폭을 붙인 다음 날카로운 모서리 가위를 사용하여 달걀 껍질 가장자리에 작은 구멍을 뚫고 약 75도 각도로 5mL 주사기를 삽입합니다.
노른자 자루에 바늘을 삽입 한 후 천천히 알부민의 5 ~ 6 mL을 철회하십시오. 알부민을 제거한 후, 셀로테이프로 구멍을 다시 밀봉하고 다음 48 시간 동안 37도 섭씨 계란 인큐베이터에 계란을 다시 넣습니다. 4일차.
4일째 요구 사항. 절차. 이 원고에 제공된 테이블에 따라 링어의 용액, 0.9%의 일반 식염수 및 1개의 X 인산완충식식식염을 준비한다. 그런 다음 세 가지 솔루션을 자동 복제합니다.
오토클레이브 후, 각각의 솔루션은 실온에 배치될 수 있다. 다음으로, 37도 계란 인큐베이터에서 계란을 꺼내. 이제 쉘을 절단하기 전에 셀로테이프로 창 영역을 덮습니다.
그리고 이제 달걀 껍질에 작은 구멍을 만들고 원형 개구부를 자르기 시작합니다. 이 프로세스를 창이라고 합니다. 알의 위치가 배아의 위치에 따라 조정되어야 할 수 있으므로 배아가 어떤 방향에서든 쉽게 접근할 수 있도록 원형 절단이 충분히 큰지 확인하십시오.
지금, 스테레오 줌 수술 현미경을 사용하여, 오른쪽 활력 동맥 또는 RVA를 찾습니다. 여기서, 화살표는 배아의 3일 발달 단계를 나타낸다. RVA가 위치한 후 26 G 바늘을 사용하여 RVA의 왼쪽과 오른쪽에 두 개의 작은 구멍이 있습니다.
다음으로, 도플러 혈류 영상 프로브를 RVA에 조정합니다. 도플러 혈류 영상 프로브는 허혈 부위로부터 5개 이상의 마이너스 1밀리미터를, RVA의 단면의 3분의 2를 배치해야 한다. 원하는 대로 30초에서 2분 간 플럭스 판독을 수행하십시오.
이것은 노목시아 단계 판독을 만들 것입니다. 이제 수동으로 척추 바늘의 가장자리를 성형하여 코 펜치의 도움으로 가장자리에 후크 모양을 주고 치아 집게가 있습니다. 이제 마이크로 조작자를 사용하여 오른쪽 vitalline 동맥 바로 아래에 척추 바늘을 삽입하십시오.
당신은 척추 바늘을 들어 올릴 준비가되어 있습니다. 이제 마이크로 조작기의 도움으로 도플러 혈류 플럭스가 동맥 흐름에서 최소 80 %의 감소를 보여 줄 때까지 동맥을 천천히 들어 올립니다. 도플러 플럭스에서 80% 이상의 드롭다운이 이루어지면 척추 바늘이 위쪽으로 들어 올려 5분 동안 동맥을 당깁니다.
이것은 허혈의 기간이 될 것입니다. 5 분의이 허혈 성 타이밍 후, 천천히 정상적인 혈류 수준을 복원하기 위해 마이크로 조작기의 도움으로 동맥을 해제. 이제 도플러 혈류 계는 노목시 동안 관찰된 것과 유사한 수치를 보여줘야 합니다.
이것은 RVA에 있는 재관전의 기간이 될 것입니다. I/R 공정 후, 배아에 1X PBS 2, 3방울을 적용한다. 마지막으로, Sellotape로 창을 다시 밀봉한 다음 달걀을 5시간 55분 동안 계란 인큐베이터에 다시 놓습니다.
5시간 55분 후, 달걀 인큐베이터에서 달걀을 꺼내 달걀 트레이에 놓고 창문을 다시 엽니다. 치료 요구 사항. 절차. 약물, 활성제 또는 억제제로 동맥을 치료하기 위해 RVA는 1 시간 동안 I / R 프로세스 후에 절제되어야합니다.
껍질을 벗겨 내어 멸균 100mm 페트리 접시에 담아 배아를 제거합니다. 태아가 페트리 접시에서 방출되면 스테레오 줌 수술 현미경의 지침에 안구 홍채를 사용하여 RVA를 소비하십시오. RVA의 절제 치수는 트렁크에서 1밀리미터를 뺀 15개, 트렁크쪽으로 는 마이너스 1밀리미터여야 합니다.
RVA를 절제한 후, 1X PBS로 씻어 내고 멸균 페트리 접시를 신습니다. 원하는 치료를 위해 링거 용액 500 마이크로리터로 채워진 멸균 된 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에 동맥을 넣습니다. 그리고 원심분리기 튜브에 동맥을 놓은 후, 5 시간 동안 37도 섭씨 실험실 인큐베이터에 넣습니다.
5 시간 의 배양 후, 37도 섭씨 실험실 인큐베이터에서 RVA를 꺼내 원하는 치료를 진행하십시오. 그리고 지금, 결과를 제시합니다. 허혈성 동맥에서 허혈성 재관류 연구에서 우리의 모델의 유용성을 확인하기 위해 먼저 산소 조절 단백질 150 또는 ORP150, 세포질 초산화수소 디스뮤타스 하나 또는 SOD1 및 카탈라아제의 활동을 살펴보았습니다.
I/R-처리 RV는 대조군에 비해 ORP150, 세포질 SOD1 및 카탈라아제의 증가된 활성을 보였지만, N-아세틸-L-시스테인 또는 NAC, ROS 쿼처, I/R 그룹에서 의 산화 스트레스를 감소시켰습니다. 염증 성 조사를 위한 이 모형의 유용성을 확립하기 위하여는, 우리는 I/R 처리RV대 제어 RV에서 I/R-1 베타 및 TNF-알파의 표현을 보았습니다. 두 인터류신은 대조군에 비해 후크-I/R 군에서 과대 발현된 것으로 나타났다.
나링게닌의 보충, 항 염증 약물, 크게 IL1 베타뿐만 아니라 TNF 알파의 수준을 감소. 다음으로, 우리는 서양 블로팅을 통해 NLRP3 및 NF-kappa 베타의 표현을 검사했습니다. 이 분석은 RVA에서 생성된 I/R에 대한 응답으로 NLRP3 인플라머솜뿐만 아니라 NF-kappa 베타의 활성화증거를 발견했습니다.
이전 결과와 마찬가지로 나링게닌은 NLRP3 및 NF-카파 베타의 발현을 감소시다. 이러한 결과는 우리의 모델이 염증성 변화를 조사하는 데 사용될 수 있음을 입증했습니다. 다음으로, 우리는 세포사멸 및 자가식 통로에 I/R의 효력을 검토했습니다.
먼저 그림 A에서는 갈라진 카스파세-3의 표현에 액세스했습니다. 제어군에 비해 I/R 그룹에서 카스파제-3의 향상된 표현을 관찰했으며, ZVADFMK를 받는 I/R 그룹은 카스파제-3의 발현이 감소하는 것을 보였다. 유사하게, I/R 군은 높은 단백질 수준을 나타냈다 LC3, 자가식 마커 Beclin-1, 포유류 세포에서 자가phagy의 주요 레귤레이터, 및 ATG-7, 대조군보다, 대조군보다, 3-ma를 수신하는 동안, 자가당 억제제, 3단백질 위의 단백질의 발현감소를 보였다. 수치 B에서 D.에 명백한 그림 E는 암브라-1 및 ATG-7 mRNA 수준에 후크 매개 I/R의 효과를 보여줍니다.
이러한 결과는 이전 결과와 일치하여, 즉, 향상된 mRNA 발현을 각각의 대조군에 비해 I/R-처리 RVA에서 암브라-1 및 ATG-7을 관찰하였다. 그러나 3ma가 I/R 그룹에 추가되었을 때 결과가 반전되었습니다. 현재 그림은 DNA의 변화를 연구하는 모델의 효과를 나타냅니다.
우리는 대조군에 비해 I/R 처리 군에서 강렬한 DNA 얼룩을 관찰하였다. 그러나, I/R RVA 그룹에 NAC의 보충 결과 반전. 모델이 다른 모델과 달리 얼마나 효과적인지 검사하기 위해 Hook-I/R 모델과 현재 실험에서 MCAO 모델에서 생성된 데이터를 비교했습니다.
간단히 말해서, 세포 단백질, 갈라진 카스파제-3, 자가단백질, 베클린-1 및 ATG-7, 및 염증성 인터류신, TNF 및 IFN의 발현은 제어 RVA보다 I/R 처리 RVA에서 더 높을 수밖에 없었다. 흥미롭게도, Hook-I/R 모델은 염증성 스트레스 또는 세포 사멸 경로에 대한 분석이든 MCAO 모델에 의해 얻은 것과 매우 유사한 결과를 주었습니다. 우리의 모델은 일상적인 허혈 재관전 실험에 사용할 수 있습니다.
그러나 허혈 재퍼퓨전을 모방하는 동안 RVA의 오른쪽과 왼쪽에 구멍을 만드는 동안, 그리고 RVA를 폐색하거나 방출하는 동안 동맥이나 정맥을 손상시키지 않도록 가장 높은 예방 조치를 취해야 합니다. 서양 블로팅과 같은 일상적인 분자 생물학에서 QRT-PCR 분석기, 화학산 및 이미징 기술은 병아리 배아를 개발하는 3 일 동안 허혈 -reperfusion과 관련된 병리생리학을 연관시키기 위해 즉흥적으로 이루어질 수 있습니다. 이 모형은 DNA, RNA 및 단백질 수준에 분자 역학을 공부하기 위하여 능량하게 이용될 수 있었습니다.
우리가 당신을 보여 주었다, 병아리 배아를 개발 3 일 I / R 모델링, 우리는 우리의 모델이 I / R 연구의 분야에서 새로운 길을 열 것이라고 생각합니다. 이 작품을 통해 실험에 최선을 다해 드리길 바랍니다. 감사합니다.
