こんにちは、私はインドのラクナウにあるエラ大学キャンパスのバイオテクノロジー学科にある幹細胞修復神経学研究所の主任研究者であるSyed Shadab Raza博士です。私の研究室では、虚血再灌流障害の根底にある病態生理学的メカニズムと、その過程を逆転させる介入を理解するよう努めています。この文脈では、虚血性脳卒中のインビトロおよびインビボモデルを頻繁に採用する。
最近、3日間でひよこ胚を発症する虚血再灌流傷害モデルを作成しました。だから今、私の学生は、ひよこ胚を開発する3日間で虚血再灌流傷害を複製する方法を紹介するつもりです。今、私たちは3日間のひよこ胚で虚血再灌流を作成する方法を紹介するつもりです。
当社のモデルは、費用対効果が高く、時間効果が高く、非常に再現性が高い。それでは、始めましょう。1日目。
初日の要件。プロシージャ。ティッシュペーパーワイプを使用して70%エタノールでゼロデーエッグをきれいにします。次に、OHPマーカー付きの卵に現在の日、日付を書き、摂氏36〜37度の温度と湿度60〜65%の卵インキュベーターに卵を入れます。
次の24時間卵をインキュベートします。2日目。2 日目の要件。プロシージャ。
手術用はさみを70%エタノールで拭くか、オートクレーブを続ける。24時間のインキュベーションの後、卵をインキュベーターから取り出して重ねます。次に、セロテープの小片を卵の端に約1インチの長さと幅に取り付け、鋭利な尖ったエッジハサミを使用して卵殻の端に小さな穴を開け、その後、約75度の角度で5 mLシリンジを挿入します。
卵黄袋に針を挿入した後、ゆっくりとアルブミンの5〜6 mLを引き出します。アルブミンを取り外した後、セロテープで穴を再シールし、次の48時間、37度の摂氏卵インキュベーターに卵を戻します。4日目。
4日目の要件。プロシージャ。リンガーの溶液、0.9%正常生理食塩水、1つのXリン酸緩衝液生理食塩水を、この原稿に記載されている表に従って準備します。その後、3つのソリューションをオートクレーブします。
オートクレーブの後、それぞれの溶液は室温で置かれてもよい。次に、37度の卵インキュベーターから卵を取り出します。シェルを切断する前に、Sellotapeで窓の領域をカバーします。
そして今、卵の殻に小さな穴を作り、円形の開口部を切断し始めます。このプロセスはウィンドウと呼ばれます。卵の位置を胚の位置に合わせて調整する必要があるため、胚が任意の方向から容易にアクセスできるように、円形カットが十分に大きかっていることを確認してください。
さて、ステレオズーム手術顕微鏡を使用して、右のバイタルライン動脈またはRVAを見つける。ここでは、矢印は胚の3日間の発達段階を示す。RVAが配置されると、26 G針を使用して、RVAの左右に2つの小さな穴を作ります。
次に、ドップラー血流イメージングプローブをRVAに調整します。ドップラー血流イメージングプローブは、虚血部位から5プラスマイナス1ミリメートル、RVAの遠位端の3分の2を配置する必要があります。必要に応じて、30秒から2分間のフラックス読み取りを行います。
これはノルモキシア相の読み取りを行います。今手動で手動で歯の鉗子に続く鼻のペンチの助けを借りてフックの形を与えるために脊髄の端を成形します。さて、マイクロマニピュレーターを使用して、右のバイタルライン動脈のすぐ下に脊髄針を挿入する。
あなたは、脊髄針を持ち上げる準備ができています。今、マイクロマニピュレータの助けを借りて、ドップラー血流フラックスが動脈流量の最低80%の減少を示すまで、ゆっくりと動脈を持ち上げる。ドップラーフラックスで80%以上のドロップダウンが達成されたら、脊髄針を上に持ち上げ、動脈を5分間引っ張ります。
これは虚血の期間になります。5分のこの虚血タイミングの後、正常な血流レベルを回復させるためにマイクロマニピュレーターの助けを借りてゆっくりと動脈を解放する。今、ドップラー血流メーターは、ノルモキシア中に観察されたものと同様の測定値を示す必要があります。
これはRVAの再灌流の期間になります。I/Rプロセス後、胚に2滴、3滴の1XPBSを塗布する。最後にセロテープで窓を再シールし、卵を卵インキュベーターに5時間55分間戻します。
5時間55分後、卵インキュベーターから卵を取り出し、卵トレイに置き、窓を開け直します。治療要件。プロシージャ。薬物、活性化剤または阻害剤による動脈の治療のために、RVAはI/ Rプロセスの1時間後に切除されるべきである。
胚をシェルから無菌100 mmペトリ皿に取り出して取り除きます。胚がペトリ皿で放出されたら、ステレオズーム手術顕微鏡の指導に眼虹彩を使用してRVAを切除する。RVA の切除寸法は、トランクから 15 + マイナス 1 ミリメートル、トランクに向かって 2 プラスマイナス 1 ミリメートルにする必要があります。
RVAを切除した後、新しい滅菌ペトリ皿で1X PBSで洗浄します。所望の処置のために、リンガーの溶液の500マイクロリットルで満たされた殺菌された1.5ミリリットル遠心管に動脈を入れる。遠心分離管に動脈を入れた後、37度の摂氏検査室のインキュベーターに5時間入れる。
5時間のインキュベーションの後、37°Cの実験室のインキュベーターからRVAを取り出し、所望の処置のために進む。そして今、結果を提示する。虚血性動脈における虚血再灌流研究におけるモデルの有用性を検証するために、まず酸素調節タンパク質150またはORP150、細胞質スーパーオキシドジスムターゼ1またはSOD1およびカタラーゼの活動を調えた。
I/R処理RVAは、対照群と比較するとORP150、細胞質SOD1およびカタラーゼの活性が増加したが、現在の図で明らかなように、N-アセチル-L-システイン、またはNAC、ROSクエンチャー、I/R群の酸化ストレスの減少を補った。炎症調査のためにこのモデルの有用性を確立するために、I/R処理RVA対対照RVAにおけるI/R-1ベータおよびTNF-αの発現を調べた。インターロイキンはいずれも対照群と比較してフックI/R群で過剰発現していることが判明した。
抗炎症薬であるナリンゲンの補充は、Il1-βとTNF-αのレベルを有意に低下させた。次に、ウェスタンブロッティングを介したNLRP3およびNF-κベータの発現を調べた。この分析は、RVAで産生されたI/Rに応答して、NLRP3インフラマソームの活性化の証拠と、NF-κベータの証拠を発見した。
以前の結果と同様に、ナリンゲンはNLRP3およびNF-κベータの発現を減少させた。これらの結果は、我々のモデルが炎症変化を調査するために使用できることを実証した。次に、アポトーシスおよびオートファジー経路に対するI/Rの効果を検討した。
まず、図Aでは、切断カスパーゼ-3の式にアクセスしました。コントロール群と比較してI/R群における切断カスパーゼ-3の発現が増強され、ZVADFMKを受けているI/R群はカスパーゼ-3の発現の減少を示した。オートファジーの場合も同様に、I/R群はLC3の高いタンパク質レベルを示し、哺乳類細胞におけるオートファジーの主要な調節因子であるオートファゴソームマーカーBeclin-1、およびATG-7は、対照群よりも基底オートファジーに必要なタンパク質であり、オートファジー阻害剤である3-maを受けているグループは、上記の3つのオートファジー阻害剤の発現の減少を示した。 図BからD.までの明らかなように図Eは、アンブラ-1およびATG-7 mRNAレベルに対するフック媒介I/Rの効果を示している。
これらの結果は、以前の結果と一致した、すなわち、I/R処理されたRVAにおけるアンブラ-1およびATG-7に対するmRNA発現の増強が、それぞれの対照と比較して観察された。しかし、I/Rグループに3-maを追加すると結果が逆転した。現在の図は、DNAの変化を研究するためのモデルの有効性を表しています。
コントロール群と比較して、I/R処理群に強いDNA塗抹標本を観察した。しかし、I/R RVAグループへのNACの補充は結果を逆転させた。他のモデルと比べてモデルの効果を調べるには、今回の実験でフックI/RモデルとMCAOモデルで生成したデータを比較しました。
簡単に言えば、アポトーシスタンパク質の発現は、切断カスパーゼ-3、オートファジータンパク質、ベクリン-1およびATG-7、および炎症性インターロイキン、TNFおよびIFNにおいて、コントロールRVAよりも高くなるはずだった。興味深いことに、Hook-I/Rモデルは、炎症性ストレスや細胞死経路の分析であったかどうかにかかわらず、MCAOモデルによって得られたものと非常によく似た結果を得た。我々のモデルは、既存のモデルに単独または平行のいずれかのルーチン虚血再灌流実験に使用することができます。
しかし、虚血再灌流を模倣する際には、RVAの左右の穴を開ける際、また、動脈や静脈を損傷しないようにRVAを閉塞または放出する際に、最も高い予防措置を講じるべきである。ウエスタンブロッティング、QRT-PCR分析装置、化学酸、イメージング技術などの日常的な分子生物学では、3日間で核血症再灌流に関連する病態生理学を関連付けるために即興でひよこ胚を発症する可能性があります。このモデルは、DNA、RNA、タンパク質レベルで分子力学を効率的に研究するために使用できます。
私たちが示したように、ひよこ胚を開発する3日間のI/Rモデリングは、私たちのモデルがI / R研究の分野で新しい道を開くと信じています。この作品で、私はあなたの実験のためにあなたにすべてのベストを願っています。ありがとうございました。
