Hola, soy el Dr. Syed Shadab Raza, el investigador principal del Laboratorio de Células Madre y Neurología Restaurativa, ubicado en el Departamento de Biotecnología del Campus de la Universidad de Era, Lucknow, India. En mi laboratorio, nos esforzamos por comprender el mecanismo fisiopatológico subyacente a los trastornos de isquemia-reperfusión y las intervenciones que pueden revertir esos procesos. En este contexto, con frecuencia empleamos el modelo in vitro e in vivo de accidente cerebrovascular isquémico.
Recientemente, hemos creado un modelo de lesión por reperfusión isquémica en un embrión de pollito de tres días en desarrollo. Así que ahora mis estudiantes les mostrarán cómo replicar la lesión de isquemia-reperfusión en un embrión de pollito en desarrollo de tres días. Ahora vamos a mostrarte cómo crear isquemia-reperfusión en un embrión de pollito de tres días.
Nuestro modelo es rentable, eficaz en el tiempo y altamente reproducible. Así que comencemos. Día uno.
Requisitos para el primer día. Procedimiento. Limpie el huevo de día cero con etanol al 70% con toallitas de papel de seda. A continuación, escriba el día actual, la fecha, en los huevos con el marcador OHP y luego coloque los huevos en una incubadora de huevos con una temperatura de 36 a 37 grados centígrados y 60 a 65% de humedad.
Incubar los huevos durante las próximas 24 horas. Día dos. Requisitos para el segundo día. Procedimiento.
Limpie la tijera quirúrgica con etanol al 70% o seguido de un autoclave. Después de 24 horas de incubación, retire el huevo de la incubadora para ponerlo en capas. A continuación, coloque un pequeño trozo de Sellotape de aproximadamente una pulgada de largo y ancho al borde del huevo y luego haga un pequeño agujero en el borde de la cáscara del huevo con la tijera de borde afilado seguido de la inserción de una jeringa de cinco ml en un ángulo de aproximadamente 75 grados.
Después de insertar la aguja en el saco de yema, retire lentamente de cinco a seis ml de albúmina. Después de quitar la albúmina, vuelva a sellar el orificio con Sellotape y vuelva a colocar el huevo en la incubadora de huevos centígrados de 37 grados durante las próximas 48 horas. Día cuatro.
Requisitos para el cuarto día. Procedimiento. Prepare la solución de Ringer, solución salina normal al 0,9% y una solución salina tampón de fosfato X según las tablas proporcionadas en este manuscrito. Luego autoclave las tres soluciones.
Después del autoclave, las soluciones respectivas se pueden colocar a temperatura ambiente. A continuación, saque el huevo de la incubadora de huevos de 37 grados. Ahora, antes de cortar la cáscara, cubra el área de ventanas con Sellotape.
Y ahora haga un pequeño agujero en la cáscara del huevo y comience a cortar una abertura circular. Este proceso se conoce como ventana. Asegúrese de que el corte circular sea lo suficientemente grande como para que el embrión pueda ser fácilmente accesible desde cualquier dirección, ya que el posicionamiento del óvulo puede tener que ajustarse según la posición del embrión.
Ahora, usando un microscopio quirúrgico de zoom estéreo, localice la arteria vital derecha o RVA. Aquí, la flecha indica la etapa de desarrollo de tres días del embrión. Una vez localizado el RVA, con el uso de una aguja de 26 G se hacen dos pequeños orificios en los lados izquierdo y derecho del RVA.
A continuación, ajuste la sonda de imágenes de flujo sanguíneo Doppler en el RVA. La sonda de imágenes de flujo sanguíneo Doppler debe colocarse a cinco más menos un milímetro del sitio de isquemia y dos tercios del extremo distal de la RVA. Tome la lectura de flujo durante 30 segundos a dos minutos, según lo desee.
Esto hará que la lectura de la fase normoxia. Ahora moldee manualmente el borde de la aguja espinal para darle al borde una forma de gancho con la ayuda de un alicate nasal seguido de pinzas dentales. Ahora, usando un micromanipulador, inserte la aguja espinal justo debajo de la arteria vital derecha.
Usted está listo para levantar la aguja espinal. Ahora, con la ayuda del micromanipulador, levante lentamente la arteria hasta que el flujo sanguíneo Doppler muestre una disminución mínima del 80% en el flujo arterial. Una vez que se logre una caída del 80% o más en el flujo Doppler, deje la aguja espinal levantada hacia arriba, tirando de la arteria durante cinco minutos.
Este será el período de isquemia. Después de este tiempo isquémico de cinco minutos, libere lentamente la arteria con la ayuda de un micro manipulador para restaurar los niveles normales de flujo sanguíneo. Ahora el medidor de flujo sanguíneo Doppler debe mostrar lecturas similares a las observadas durante la normoxia.
Este será el período de reperfusión en la RVA. Después del proceso de I / R, aplique dos, tres gotas de 1X PBS al embrión. Finalmente, vuelva a sellar la ventana con Sellotape y luego coloque el huevo de nuevo en la incubadora de huevos durante cinco horas y 55 minutos.
Después de cinco horas y 55 minutos, saque el huevo de la incubadora de huevos y colóquelo en la bandeja de huevos y vuelva a abrir la ventana. Requisitos de tratamiento. Procedimiento. Para el tratamiento de las arterias con los medicamentos, activadores o inhibidores, el RVA debe extirparse después de una hora de proceso de I / R.
Retire el embrión de la cáscara sacándolo de la cáscara en una placa de Petri estéril de 100 mm. Una vez que el embrión se libera en la placa de Petri, extirpe el RVA utilizando el iris ocular en la guía del microscopio quirúrgico de zoom estéreo. La dimensión de escisión de RVA debe ser de hasta 15 más menos un milímetro distal desde el tronco y dos más menos un milímetro hacia el tronco.
Después de extirpar el RVA, lávelo con 1X PBS en una nueva placa de Petri estéril. Para los tratamientos deseados, coloque la arteria en un tubo centrífugo esterilizado de 1,5 mililitros lleno de 500 microlitros de solución de Ringer. Y después de colocar la arteria en el tubo de la centrífuga, colóquela en la incubadora de laboratorio de 37 grados centígrados durante cinco horas.
Después de cinco horas de incubación, saque el RVA de la incubadora de laboratorio de 37 grados centígrados y proceda a los tratamientos deseados. Y ahora, para presentar los resultados. Para verificar la utilidad de nuestro modelo en la investigación de la reperfusión isquémica en arterias isquémicas, primero observamos las actividades de las proteínas reguladoras de oxígeno 150 u ORP150, superóxido citoplasmático dismutasa uno o SOD1 y catalasa.
Los RVA tratados con I/R mostraron una mayor actividad de ORP150, SOD1 citoplasmático y catalasa en comparación con el grupo control, sin embargo, la suplementación con N-acetil-L-cisteína, o NAC, un quencher ROS, redujo el estrés oxidativo en el grupo I/R, como puede ser evidente en la figura actual. Para establecer la utilidad de este modelo para las investigaciones inflamatorias, observamos la expresión de I/R-1 beta y TNF-alfa en RVAs tratados con I/R versus RVAs de control. Se encontró que ambas interleucinas estaban sobreexpresadas en el grupo de Hook-I /R en comparación con el grupo de control.
La suplementación de Naringenina, un medicamento antiinflamatorio, redujo significativamente los niveles de IL1-beta y TNF-alfa. A continuación, examinamos la expresión de NLRP3 y NF-kappa beta a través de Western blotting. Este análisis descubrió evidencia de activación del inflamasoma NLRP3, así como NF-kappa beta en respuesta a I/R producida en el RVA.
Al igual que en resultados anteriores, Naringenin redujo la expresión de NLRP3 y NF-kappa beta. Estos resultados demostraron que nuestro modelo podría ser utilizado para investigar alteraciones inflamatorias. A continuación, examinamos el efecto de I/R sobre las vías de apoptosis y autofagia.
En primer lugar, en la figura A, accedimos a la expresión de caspasa-3 escindida. Observamos una mayor expresión de caspasa-3 escindida en el grupo I/R en comparación con el grupo control, mientras que el grupo I/R que recibió ZVADFMK mostró una disminución en la expresión de caspasa-3. De manera similar para la autofagia, el grupo I / R exhibió altos niveles de proteínas de LC3, el marcador de autofagosoma Beclin-1, un regulador clave de la autofagia en células de mamíferos, y ATG-7, una proteína requerida para la autofagia basal, que el grupo de control, mientras que los grupos que recibieron 3-ma, un inhibidor de la autofagia, mostraron una disminución en la expresión de las tres proteínas de autofagia anteriores, como se desprende de las figuras B a D.La figura E demuestra el efecto de la I/R mediada por Hook sobre los niveles de ARNm de ambra-1 y ATG-7.
Estos resultados estuvieron en línea con los resultados anteriores, es decir, se observó una mayor expresión de ARNm para ambra-1 y ATG-7 en RVAs tratados con I/R en comparación con sus respectivos controles. Sin embargo, los resultados se invirtieron cuando se agregaron 3-ma al grupo I/R. La figura actual representa la eficacia de nuestro modelo para estudiar las alteraciones en el ADN.
Observamos un frotis de ADN intenso en el grupo tratado con I/R en comparación con el grupo control. Sin embargo, la suplementación de NAC al grupo I/R RVA revirtió el resultado. Para examinar qué tan efectivo es nuestro modelo en contraste con otros modelos, comparamos los datos generados por nuestro modelo Hook-I / R y el modelo MCAO en el presente experimento.
En resumen, la expresión de la proteína apoptótica, caspasa-3 escindida, las proteínas de autofagia, Beclin-1 y ATG-7, y las interleucinas inflamatorias, TNF e IFN, se unió a ser mayor en los RVA tratados con I/R que en los RVA de control. Curiosamente, el modelo Hook-I/R dio resultados muy similares a los obtenidos por el modelo MCAO, ya fuera el análisis del estrés inflamatorio o las vías de muerte celular. Nuestro modelo se puede utilizar para experimentos rutinarios de isquemia-reperfusión, ya sea solo o paralelo a los modelos existentes.
Sin embargo, durante la imitación de la isquemia-reperfusión, se debe tomar una mayor precaución al hacer agujeros, lado derecho e izquierdo de la RVA, y también al ocluir o liberar la RVA para que no dañe ninguna arteria o vena. En la biología molecular de rutina, como el Western blotting, el analizador QRT-PCR, los ácidos químicos y las técnicas de imagen, se podrían improvisar para asociar la fisiopatología asociada con la isquemia-reperfusión en un embrión de pollito en desarrollo de tres días. Este modelo podría usarse eficientemente para estudiar la mecánica molecular a nivel de ADN, ARN y proteínas.
Como te hemos mostrado, el modelado I/R en un embrión de pollito de tres días en desarrollo, creemos que nuestro modelo abrirá nuevas vías en el campo de la investigación I/R. Con este trabajo, les deseo todo lo mejor para sus experimentos. Gracias.
