Rekombinant proteinin bakterilerden saflaştırılması köklü bir yöntemdir. Ancak, bu teknikleri kullanırken çeşitli sorunlar ortaya çıkabilir. Dokudan protein çıkarmak için yöntemlere sahip olmak kesinlikle çekicidir.
Bu yöntemin temel avantajı, katlanma ve katalitik aktivitesini etkileyebilecek tüm karşılıklı etkiler de dahil olmak üzere proteini fizyolojik formunda çıkarabilmesidir. Bu yaklaşım, ilgilenilen diğer proteinlere uyarlanabilir ve diğer dokular için modifiye edilebilir. Dokudan saflaştırılmış protein, yüksek kaliteli antikorların ve farmakolojik inhibitörlerin gelişimini destekleyebilir.
Başlamak için, 250 mililitre PBS'yi 50 milimolar sodyum florür, bir milimolar fenilmetilsülfonil florür, mililitre aprotinin başına iki mikrogram ve bir milimolar aktif ortovanadat ile karıştırarak protein lizis tamponu hazırlayın. 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtre ünitesi kullanarak çözeltiyi filtreleyin. Gram doku başına iki mililitre lizis tamponu içeren tüpler hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin.
Doku örneğini hazırlamak için, her biri yaklaşık 100 miligramlık dokuyu, bir polistiren köpük kutuda buz üzerine yerleştirilmiş önceden temizlenmiş bir cam plaka üzerinde disseke edin. Doku parçalarını sonraki lizis için hazırlanan tüplere aktarın. Doymuş bir amonyum sülfat çözeltisi hazırlamak için, 500 mililitre çift damıtılmış suyu 70 santigrat dereceye ısıtın.
Karıştırırken, daha fazla amonyum sülfat çözülmeyene kadar yavaş yavaş amonyum sülfat tozu ekleyin. Bu doymuş çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun ve gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Domuz böbrek dokularını homojenize etmek için, numuneyi buz üzerinde tutarken süspansiyonu tercihen ultrasonik bir prob ile sonikleştirin.
Fare karaciğer dokuları söz konusu olduğunda, bir elektrikli homojenizatör kullanın ve numuneleri buz üzerinde tutarken tıkanmayı önlemek için PBS'de düzenli olarak yıkayın. Numunelerden 20 mikrolitre alın ve homojenize edilmiş dokunun hücrelerinin uygun şekilde tahrip edilip edilmediğini mikroskop altında kontrol edin. Aksi takdirde, homojenizasyonu tekrarlayın.
Tüpleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze bir tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra süpernatantı 0.45 mikrometre ve 0.22 mikrometre şırınga filtre üniteleri kullanarak filtreleyin.
Süpernatantı 10 mililitrelik partilere ayırın ve kısa süreli depolama için eksi 20 santigrat derecede veya daha uzun süre depolama için eksi 80 santigrat derecede dondurun. SDS-PAGE veya Western leke analizi için 40 mikrolitre süpernatantın 40 mikrolitresine SDS numune tamponunun beş katı 10 mikrolitre ekleyerek ve ardından 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede kaynatarak 50 mikrolitrelik bir numune hazırlayın. Üreticinin talimatlarına göre% 12.5'lik süreksiz bir poliakrilamid SDS-PAGE jeli hazırlayın.
SDS-PAGE analizi yapmak için, jelin kuyucuklarını daha sonra bir protein işaretleyici merdiveni, pozitif kontrol olarak beş nanogram insan FAHD1 rekombinant proteini, analiz edilecek numunenin 20 mikrolitresi ve kalan kuyucukları 20 mikrolitre hazırlanmış SDS-PAGE numune tamponu ile yükleyin. SDS çalışma arabelleğini kullanarak SDS-PAGE jellerini 125 voltta çalıştırın. SDS-PAGE tamamlandıktan sonra, bir Western leke analizi yapın, FAHD1'e karşı yükseltilmiş mevcut antikoru kullanarak membranları araştırın.
Daha önce tarif edildiği gibi süpernatant alikotları hazırladıktan sonra, ya çözüldükten sonra ya da numuneyi dondurmadan doğrudan protein ekstraksiyonundan sonra işlem. Çözüldükten sonra olası çökelmeleri dışlamak için numuneyi 0,22 mikrometrelik bir filtre ünitesi kullanarak filtreleyin. Buz üzerinde altı adet 1,5 mililitrelik tüp hazırlayın, ardından her tüpe 250 mikrolitre numune aktarın.
Hazırlanan tüplerde bir seyreltme serisi amonyum sülfat hazırlayın ve protein lizis tamponu ile son hacmi 1.000 mikrolitreye kadar yapın. Numuneleri bir tüp rotatör üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bir masa üstü santrifüj kullanarak, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüj yapın ve tüm süpernatantları dikkatlice ayrı tüplere aktarın.
Elde edilen peletleri hava ile kurutun ve her birini 1.000 mikrolitre çift damıtılmış suda yeniden askıya alın. Önceki adımdaki her bir yeniden askıya alınmış pelet ve süpernatant çifti için, 40 mikrolitreyi SDS numune tamponunun beş katı 10 mikrolitre ile karıştırın ve sıvının çoğu buharlaşana kadar açık kapaklarla 95 santigrat derecede kaynatın. Daha sonra peleti, çift damıtılmış sudamıtılmış suda% 50 dimetil sülfoksit karışımında yeniden askıya alın.
SDS-PAGE'i, yeniden askıya alınmış peletlerden ve süpernatanttan elde edilen numuneleri çiftler halinde yükleyerek ve ardından bir Western leke analizi yaparak gerçekleştirin. Bununla birlikte, jelleri üç saat boyunca 80 voltta çalıştırın. FPLC sistemini anyonik veya katyonik değişim sütunu ile kurun.
Kolonu beş sütun haciminde% 20 etanol ile çift damıtılmış sudamıtılmış suda, ardından beş sütun hacminde çift damıtılmış su ile yıkayın. Numuneyi enjeksiyonla veya bir numune pompası kullanarak kolona uygulayın ve akışı toplayın. Kolonu düşük tuz tamponunun bir sütun hacmi ile yıkayın.
Üç sütun hacmi içinde %100 düşük tuz tamponundan %100 yüksek tuz tamponuna doğrusal bir gradyan elüsyonu ayarlayın. Sürekli olarak bir mililitre fraksiyon toplayın. Gradyan bittikten sonra, kromatogramda bir sütun hacmi aralığında proteinle ilişkili pikler tespit edilmeyene kadar yüksek bir tuz tamponu ile çalışmaya devam edin.
Kolonu temizlemek için 0.5 molar sodyum hidroksit ve çift damıtılmış su içinde çözünmüş bir mililitre% 25 SDS uygulayın. Kolonu art arda üç kolon hacminde çift damıtılmış su ve üç kolon haciminde% 20 etanol ile çift damıtılmış suda yıkayın. Tüm tepe fraksiyonlarının ve akış akışının SDS-PAGE örneklerini toplayın.
Toplanan fraksiyonları sıvı azotta çırpın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Onları Western blot yoluyla araştırdıktan sonra, ilgilenilen proteinleri içeren fraksiyonları çözün ve bir araya getirin ve diğerlerini atın. Saflaştırma adımını gerçekleştirmek için, ultra santrifüjleme filtre üniteleri kullanarak protein çözeltisinin hacmini iki mililitreye düşürün.
Herhangi bir mikro çökeltiyi gidermek için çözeltiyi 0,45 mikrometre ve 0,22 mikrometre şırınga filtre üniteleri ile sırayla filtreleyin. Boyut dışlama kromatografisi sütununu, bir milimolar ditiyotreitol içeren bir sütun hacminde çalışan tamponla dengeleyin. Numuneyi kolona yükleyin ve tüm proteinler daha önce tarif edildiği gibi salınana kadar kromatografi ünitesini çalıştırın.
Daha önce açıklanan SDS-PAGE ve Western blot analizi için 50 mikrolitrelik numuneler hazırlayın. Kolonu art arda çift damıtılmış su hacminde ve bir sütun hacminde% 20 etanol ile çift damıtılmış suda yıkayın. Western blot analizini yaptıktan sonra, fraksiyonları içeren tüm FAHD1'leri bir araya getirin.
Ultra santrifüjleme filtre üniteleri kullanarak protein çözeltisinin hacmini iki mililitreye düşürün. Batı leke taraması, süpernatantta domuz FAHD1'in varlığını 25 kilodaltonda bir bantla gösterirken, etiketli pozitif kontrol 34 kilodaltonda çalışır. Lisattan elde edilen domuz FAHD1, anyonik değişim kromatografisi ile saflaştırıldı ve bağlayıcı proteinler elüsyon ile uzaklaştırıldı.
Domuz FAHD1 içeren fraksiyonlar Batı leke analizi ile tanımlanmış, havuzlanmış ve konsantre edilmiştir. Protein örnekleri SEC tarafından saflaştırıldı ve Western blot analizi ile tanımlandı. Domuz FAHD1 proteininin verimi,% 80 saflık seviyesine sahip yaklaşık bir miligram idi.
Batı leke analizi, diğer proteinlerle birlikte akışta fare FAHD1 proteinini tespit etti. Akış, boyut dışlama kromatografisi için uygulandı. FAHD1 içeren fraksiyonlar bir araya getirildi, konsantre edildi ve SDS-PAGE analizine uygulandı.
Bununla birlikte, protein verimi çok yüksek değildi. Domuz FAHD1'in spesifik enzimatik aktivitesi, toplam protein başına göreceli FAHD1 miktarını arttırdıktan sonra saflık seviyesi ile artar. Daha yüksek amonyum sülfat konsantrasyonları, daha düşük voltajda çözülebilen gülümseme etkisine neden olur.
Lizat ve süpernatantta% 15 konsantrasyonda daha fazla protein bulundu. Bununla birlikte, daha yüksek konsantrasyonlarda, numuneler çökelebilir ve tespit edilemez. Burada sunulan protokol, proteinin çözülebilir olmasını gerektirir.
Yağış ve pH için en uygun koşullar veya kromatografi için boyut ayarı test edilmeli ve tanımlanmalıdır. Enzimatik fonksiyonun incelenmesi, protein yapısının araştırılması ve antikorun gelişimi, proteinin bakterilerden ekstrakte edilmek yerine dokudan ekstrakte edilmesiyle büyük ölçüde desteklenir.
