Die Reinigung von rekombinantem Protein aus Bakterien ist eine etablierte Methode. Bei der Verwendung dieser Techniken können jedoch mehrere Probleme auftreten. Methoden zu haben, um Protein aus Gewebe zu extrahieren, ist sicherlich ansprechend.
Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass das Protein in seiner physiologischen Form extrahiert werden kann, einschließlich aller gegenseitigen Wirkungen, die sich auf seine Faltung und katalytische Aktivität auswirken können. Dieser Ansatz kann an andere Proteine von Interesse angepasst und für anderes Gewebe modifiziert werden. Gereinigtes Protein aus Gewebe kann die Entwicklung hochwertiger Antikörper und pharmakologischer Inhibitoren unterstützen.
Bereiten Sie zunächst den Proteinlysepuffer vor, indem Sie 250 Milliliter PBS mit 50 Millimolar Natriumfluorid, einem millimolaren Phenylmethylsulfonylfluorid, zwei Mikrogramm pro Milliliter Aprotinin und einem millimolar aktivierten Orthovanadat mischen. Filtern Sie die Lösung mit einer 0,22 Mikrometer Spritzenfiltereinheit. Bereiten Sie Röhrchen mit zwei Millilitern Lysepuffer pro Gramm Gewebe vor und legen Sie sie auf Eis.
Um die Gewebeprobe vorzubereiten, sezieren Sie das Gewebe von jeweils etwa 100 Milligramm auf einer vorgereinigten Glasplatte, die auf Eis in einer Styroporschaumbox platziert ist. Die Gewebestücke zur anschließenden Lyse in die vorbereiteten Röhrchen überführen. Um eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung herzustellen, erhitzen Sie 500 Milliliter doppelt destilliertes Wasser auf 70 Grad Celsius.
Während des Rührens fügen Sie allmählich Ammoniumsulfatpulver hinzu, bis kein Ammoniumsulfat mehr gelöst ist. Kühlen Sie diese gesättigte Lösung auf Raumtemperatur ab und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Um das Schweinenierengewebe zu homogenisieren, beschallen Sie die Suspension vorzugsweise mit einer Ultraschallsonde, während Sie die Probe auf Eis halten.
Verwenden Sie im Falle von Mauslebergewebe einen elektrischen Homogenisator und waschen Sie ihn regelmäßig in PBS, um Verstopfungen zu vermeiden, während die Proben auf Eis gehalten werden. Nehmen Sie 20 Mikroliter aus den Proben und überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen des homogenisierten Gewebes richtig zerstört werden. Andernfalls wiederholen Sie die Homogenisierung.
Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in einer frischen Tube und legen Sie ihn auf Eis. Filtern Sie anschließend den Überstand mit 0,45 Mikrometer und 0,22 Mikrometer Spritzenfiltereinheiten.
Aliquot den Überstand in 10-Milliliter-Chargen und bei minus 20 Grad Celsius für die kurzfristige Lagerung oder bei minus 80 Grad Celsius für längere Lagerung einfrieren. Bereiten Sie eine 50-Mikroliter-Probe für die SDS-PAGE- oder Western-Blot-Analyse vor, indem Sie 10 Mikroliter des Fünffachen des SDS-Probenpuffers zu 40 Mikrolitern des Überstands hinzufügen und dann 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius sieden. Bereiten Sie ein diskontinuierliches 12,5% Polyacrylamid SDS-PAGE Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
Um die SDS-PAGE-Analyse durchzuführen, laden Sie die Vertiefungen des Gels anschließend mit einer Proteinmarkerleiter, fünf Nanogramm humanem FAHD1-rekombinantem Protein als Positivkontrolle, 20 Mikrolitern der zu analysierenden Probe und den verbleibenden Vertiefungen mit 20 Mikrolitern vorbereitetem SDS-PAGE-Probenpuffer. Führen Sie die SDS-PAGE-Gele mit 125 Volt unter Verwendung des SDS-Laufpuffers aus. Nachdem SDS-PAGE abgeschlossen ist, führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch und untersuchen Sie die Membranen mit dem verfügbaren Antikörper, der gegen FAHD1 erhoben wird.
Nach der Herstellung von überstehenden aliquoten, wie zuvor beschrieben, entweder nach dem Auftauen oder direkt nach der Proteinextraktion ohne Einfrieren der Probe verarbeiten. Filtern Sie die Probe mit einer 0,22 Mikrometer großen Filtereinheit, um mögliche Ausfällungen nach dem Auftauen auszuschließen. Bereiten Sie sechs 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis vor und übertragen Sie dann 250 Mikroliter Probe in jedes Röhrchen.
Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von Ammoniumsulfat in den vorbereiteten Röhrchen vor und machen Sie das endgültige Volumen auf 1.000 Mikroliter mit Proteinlysepuffer aus. Inkubieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Röhrenrotator. Mit einer Tischzentrifuge bei 10.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und alle Überstände vorsichtig in separate Röhrchen überführen.
Die resultierenden Pellets an der Luft trocknen und jedes von ihnen in 1.000 Mikroliter doppelt destilliertem Wasser resuspendieren. Mischen Sie für jedes Paar resuspendiertes Pellet und Überstand aus dem vorherigen Schritt 40 Mikroliter mit 10 Mikrolitern des Fünffachen des SDS-Probenpuffers und kochen Sie bei 95 Grad Celsius mit offenen Deckeln, bis der größte Teil der Flüssigkeit verdampft ist. Dann suspendiert das Pellet in einer Mischung aus 50% Dimethylsulfoxid in doppelt destilliertem Wasser.
Führen Sie SDS-PAGE durch, indem Sie die Proben aus den resuspendierten Pellets und dem Überstand paarweise laden, gefolgt von einer Western Blot-Analyse. Lassen Sie die Gele jedoch drei Stunden lang mit 80 Volt laufen. Richten Sie das FPLC-System mit der anionischen oder kationischen Austauschsäule ein.
Waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumina von 20% Ethanol in doppelt destilliertem Wasser, gefolgt von fünf Säulenvolumina doppelt destilliertem Wasser. Tragen Sie die Probe entweder durch Injektion oder mit einer Probenpumpe auf die Säule auf und sammeln Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule mit einem Säulenvolumen des niedrigen Salzpuffers.
Richten Sie eine lineare Gradientenelution von 100 % niedrigem Salzpuffer zu 100 % hohem Salzpuffer innerhalb von drei Säulenvolumina ein. Sammeln Sie kontinuierlich einen Milliliter Fraktionen. Nachdem der Gradient beendet ist, laufen Sie mit einem hohen Salzpuffer weiter, bis keine proteinassoziierten Peaks mehr im Chromatogramm über den Bereich eines Säulenvolumens nachgewiesen werden.
Tragen Sie einen Milliliter 25% SDS auf, gelöst in 0,5 molaren Natriumhydroxid und doppelt destilliertem Wasser, um die Säule zu reinigen. Waschen Sie die Säule nacheinander mit drei Säulenvolumina aus doppelt destilliertem Wasser und drei Säulenvolumina aus 20% Ethanol in doppelt destilliertem Wasser. Sammeln Sie die SDS-PAGE-Proben aller Spitzenfraktionen und des Durchflusses.
Die gesammelten Fraktionen in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Nachdem Sie sie über Western Blot untersucht haben, tauen und sammeln Sie die Fraktionen, die die Proteine von Interesse enthalten, und verwerfen Sie die anderen. Um den Reinigungsschritt durchzuführen, reduzieren Sie das Volumen der Proteinlösung mit Ultrazentrifugationsfiltereinheiten auf zwei Milliliter.
Filtern Sie die Lösung nacheinander mit 0,45 Mikrometer und 0,22 Mikrometer Spritzenfiltereinheiten, um Mikrofällungen zu entfernen. Gleichen Sie die Größenausschlusschromatographiespalte mit einem Spaltenvolumen des laufenden Puffers aus, das ein millimolares Dithiothreitol enthält. Laden Sie die Probe auf die Säule und führen Sie die Chromatographieeinheit aus, bis alle Proteine wie zuvor beschrieben eluiert sind.
Bereiten Sie 50-Mikroliter-Proben für die zuvor beschriebene SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse vor. Waschen Sie die Kolonne nacheinander mit einem Säulenvolumen doppelt destilliertem Wasser und einem Säulenvolumen von 20% Ethanol in doppelt destilliertem Wasser. Nach der Western Blot-Analyse werden alle FAHD1-haltigen Fraktionen gepoolt.
Reduzieren Sie das Volumen der Proteinlösung mit Ultrazentrifugationsfiltereinheiten auf zwei Milliliter. Western Blot Screening zeigt das Vorhandensein von Schweinen FAHD1 im Überstand mit einem Band bei 25 Kilodalton, während die markierte Positivkontrolle bei 34 Kilodalton läuft. Das Schwein FAHD1 aus Lysat wurde durch anionische Austauschchromatographie gereinigt und die Bindungsproteine durch Elution entfernt.
Fraktionen, die Schweine FAHD1 enthielten, wurden durch Western Blot-Analyse identifiziert, gepoolt und konzentriert. Proteinproben wurden von der SEC gereinigt und durch westliche Blot-Analyse identifiziert. Die Ausbeute an Schweine-FAHD1-Protein betrug etwa ein Milligramm mit einem Reinheitsgrad von 80%.
Die Western-Blot-Analyse wies das FAHD1-Protein der Maus im Durchfluss zusammen mit anderen Proteinen nach. Der Durchfluss wurde für die Größenausschlusschromatographie angewendet. Fraktionen, die FAHD1 enthielten, wurden gepoolt, konzentriert und auf die SDS-PAGE-Analyse angewendet.
Die Ausbeute an Protein war jedoch nicht sehr hoch. Die spezifische enzymatische Aktivität des Schweins FAHD1 steigt mit dem Reinheitsgrad, wenn die relative Menge an FAHD1 pro Gesamtprotein erhöht wird. Höhere Konzentrationen von Ammoniumsulfat verursachen den Smile-Effekt, der bei niedrigerer Spannung aufgelöst werden kann.
Weiteres Protein wurde im Lysat und Überstand in einer Konzentration von 15% gefunden. Bei höheren Konzentrationen können Proben jedoch ausfallen und können nicht nachgewiesen werden. Das hier vorgestellte Protokoll verlangt, dass das Protein lösbar ist.
Optimale Bedingungen für Niederschlag und pH- oder Größenanpassung für die Chromatographie müssen getestet und definiert werden. Die Untersuchung der enzymatischen Funktion, die Untersuchung der Proteinstruktur und die Entwicklung von Antikörpern werden stark unterstützt, wenn Protein aus Gewebe extrahiert und nicht aus Bakterien extrahiert wird.
