Очистка рекомбинантного белка от бактерий является хорошо зарекомендовавшим себя методом. Однако при использовании этих методов может возникнуть несколько проблем. Наличие методов извлечения белка из ткани, безусловно, привлекательно.
Основным преимуществом этого метода является то, что можно извлечь белок в его физиологической форме, включая все взаимные эффекты, которые могут повлиять на его складчатую и каталитическую активность. Этот подход может быть адаптирован к другим белкам, представляющим интерес, и модифицирован для других тканей. Очищенный белок из ткани может поддерживать выработку высококачественных антител и фармакологических ингибиторов.
Для начала подготовьте буфер лизиса белка, смешав 250 миллилитров PBS с 50 миллимолярами фторида натрия, одним миллимолярным фенилметилсульфонилфторидом, двумя микрограммами на миллилитр апротинина и одним миллимолярным активированным ортованадатом. Отфильтруйте раствор с помощью шприцевого фильтра длиной 0,22 микрометра. Подготовьте пробирки с двумя миллилитрами буфера лизиса на грамм ткани и поместите их на лед.
Чтобы подготовить образец ткани, рассекните ткань примерно по 100 миллиграммов каждая на предварительно очищенной стеклянной пластине, помещенной на лед в коробке из пенополистирола. Переложите кусочки ткани в подготовленные пробирки для последующего лизиса. Для приготовления насыщенного раствора сульфата аммония нагревают 500 миллилитров двойной дистиллированной воды до 70 градусов Цельсия.
Во время перемешивания постепенно добавляйте порошок сульфата аммония до тех пор, пока не растворится сульфат аммония. Охладите этот насыщенный раствор до комнатной температуры и храните его при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Чтобы гомогенизировать ткани почек свиней, обжайте суспензию ультразвуком, предпочтительно ультразвуковым зондом, сохраняя образец на льду.
В случае тканей печени мышей используйте электрический гомогенизатор и регулярно мойте его в PBS, чтобы предотвратить засорение при сохранении образцов на льду. Возьмите 20 микролитров из образцов и проверьте под микроскопом, правильно ли разрушены клетки гомогенизированной ткани. В противном случае повторите гомогенизацию.
Центрифугируйте трубки в 10 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите супернатант в свежую трубку и поместите его на лед. Впоследствии фильтруйте супернатант с помощью 0,45-микрометрового и 0,22-микрометрового шприцевых фильтрующих блоков.
Аликвоцитируйте супернатант в партии по 10 миллилитров и замораживайте их при минус 20 градусах Цельсия для кратковременного хранения или при минус 80 градусах Цельсия для более длительного хранения. Подготовьте 50-микролитровый образец для анализа SDS-PAGE или western blot, добавив 10 микролитров в пять раз больше буфера образца SDS к 40 микролитрам супернатанта, а затем кипятя при 95 градусах Цельсия в течение 10 минут. Приготовьте прерывистый 12,5% полиакриламидный гель SDS-PAGE в соответствии с инструкциями производителя.
Для выполнения анализа SDS-PAGE загрузите скважины геля впоследствии белковой маркерной лестницей, пятью нанограммами человеческого рекомбинантного белка FAHD1 в качестве положительного контроля, 20 микролитрами образца, подлежащего анализу, и оставшимися скважинами с 20 микролитрами подготовленного буфера образца SDS-PAGE. Запускайте гели SDS-PAGE со скоростью 125 В, используя работающий буфер SDS. После того, как SDS-PAGE будет завершен, выполните анализ вестерн-блоттинга, исследуйте мембраны, используя доступное антитело, поднятое против FAHD1.
После получения супернатантных аликвот, как описано ранее, либо обрабатывают после оттаивания, либо обрабатывают непосредственно после экстракции белка без замораживания образца. Отфильтруйте образец с помощью фильтрующего блока размером 0,22 микрометра, чтобы исключить возможные осадки после оттаивания. Подготовьте шесть 1,5 миллилитровых пробирок на льду, затем переложите 250 микролитров образца в каждую пробирку.
Готовят серию разведения сульфата аммония в подготовленных пробирках и составляют конечный объем до 1000 микролитров с буфером лизиса белка. Инкубируйте образцы при четырех градусах Цельсия в течение ночи на трубчатом ротаторе. Используя настольную центрифугу, центрифугу в 10 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и аккуратно переложите все супернатанты в отдельные трубки.
Высушите полученные гранулы на воздухе и повторно суспендируйте каждую из них в 1000 микролитрах двойной дистиллированной воды. Для каждой пары повторно суспендированных гранул и супернатанта с предыдущего этапа смешайте 40 микролитров с 10 микролитрами, в пять раз превышающими буфер образца SDS, и кипятите при 95 градусах Цельсия с открытыми крышками, пока большая часть жидкости не испарится. Затем повторно суспендируют гранулу в смеси 50%-диметилсульфоксида в двойной дистиллированной воде.
Выполните SDS-PAGE, загрузив образцы, полученные из повторно суспендированных гранул и супернатанта парами, с последующим анализом вестерн-блоттинга. Тем не менее, запускайте гели при 80 вольтах в течение трех часов. Настройте систему FPLC с анионной или катионной обменной колонкой.
Промыть колонну с пятью колоннами объемов 20% этанола в двойной дистиллированной воде, а затем пять колонн объемов двойной дистиллированной воды. Нанесите образец на колонну либо путем впрыска, либо с помощью насоса для отбора проб и соберите поток. Вымойте колонну одним объемом колонны низкосолевого буфера.
Настройте линейное градиентное элюирование от 100% низкосолевого буфера до 100%-го солевого буфера в трех колонных объемах. Непрерывно собирать одну миллилитровую фракцию. После завершения градиента продолжайте работать с буфером с высоким содержанием соли до тех пор, пока в хроматограмме больше не будут обнаружены связанные с белком пики в диапазоне объема в одну колонку.
Нанесите один миллилитр 25% SDS, растворенный в 0,5 молярном гидроксиде натрия, и двойную дистиллированную воду для очистки колонны. Последовательно промывайте колонну с тремя колоннами объемов двойной дистиллированной воды и тремя колоннами объемов 20% этанола в двойной дистиллированной воде. Соберите образцы SDS-PAGE всех пиковых фракций и сквозного потока.
Заморозьте собранные фракции в жидком азоте и храните их при минус 80 градусах Цельсия. После их зондирования с помощью вестерн-блоттинга, разморозьте и объедините фракции, содержащие интересующие белки, и выбросьте остальные. Для выполнения стадии очистки уменьшите объем белкового раствора до двух миллилитров с помощью ультрацентрифугирующих фильтрующих установок.
Последовательно фильтруйте раствор с помощью 0,45 микрометра и 0,22 микрометра шприцевых фильтрующих блоков для удаления любых микропреципитаций. Уравновешивают размер исключающей хроматографической колонки с одним столбцом объема работающего буфера, содержащего один миллимолярный дитиотрейтол. Загрузите образец на колонку и запустите блок хроматографии до тех пор, пока все белки не будут элюированы, как описано ранее.
Подготовьте 50 микролитровых образцов для анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга, описанного выше. Последовательно промывайте колонну с одним столбом объема двойной дистиллированной воды и одной колонкой объемом 20% этанола в двойной дистиллированной воде. После выполнения анализа вестерн-блотта объедините все фракции, содержащие FAHD1.
Уменьшите объем белкового раствора до двух миллилитров с помощью ультрацентрифугирующих фильтрующих устройств. Скрининг вестерн-блот показывает присутствие свиней FAHD1 в супернатанте с полосой в 25 килодалтонах, в то время как помеченный положительный контроль работает на 34 килодалтонах. Свиней FAHD1 из лизата очищали с помощью анионнообменной хроматографии, а связывающие белки удаляли элюированием.
Фракции, содержащие свиней FAHD1, были идентифицированы путем анализа вестерн-блоттинга, объединены и концентрированы. Образцы белка были очищены SEC и идентифицированы с помощью анализа вестерн-блоттинга. Выход свиного белка FAHD1 составил около одного миллиграмма с уровнем чистоты 80%.
Анализ вестерн-блоттинга обнаружил мышиный белок FAHD1 в потоке вместе с другими белками. Проточная была применена для размерной эксклюзионной хроматографии. Фракции, содержащие FAHD1, были объединены, сконцентрированы и применены к анализу SDS-PAGE.
Однако выход белка был не очень высоким. Специфическая ферментативная активность свиней FAHD1 увеличивается с уровнем чистоты при увеличении относительного количества FAHD1 на общий белок. Более высокие концентрации сульфата аммония вызывают эффект улыбки, который может быть разрешен при более низком напряжении.
Далее белок был обнаружен в лизате и супернатанте в концентрации 15%. Однако при более высоких концентрациях образцы могут выпадать в осадок и не могут быть обнаружены. Протокол, представленный здесь, требует, чтобы белок был разрешимым.
Оптимальные условия для осадков и pH или корректировки размера для хроматографии должны быть проверены и определены. Изучение ферментативной функции, исследование структуры белка и развитие антител в значительной степени поддерживаются при извлечении белка из ткани, а не из бактерий.
