La purificación de proteínas recombinantes de bacterias es un método bien establecido. Sin embargo, pueden ocurrir varios problemas al usar estas técnicas. Tener métodos para extraer proteínas de los tejidos es ciertamente atractivo.
La principal ventaja de este método es que se puede extraer la proteína en su forma fisiológica, incluidos todos los efectos mutuos que pueden afectar su plegamiento y actividad catalítica. Este enfoque puede adaptarse a otras proteínas de interés y modificarse para otros tejidos. La proteína purificada del tejido puede apoyar el desarrollo de anticuerpos de alta calidad e inhibidores farmacológicos.
Para comenzar, prepare el tampón de lisis de proteínas mezclando 250 mililitros de PBS con fluoruro de sodio 50 milimolar, un fluoruro de fenilmetilsulfonilo milimolar, dos microgramos por mililitro de aprotinina y un ortovanadato activado milimolar. Filtre la solución con una unidad de filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. Prepare tubos con dos mililitros de tampón de lisis por gramo de tejido y colóquelos sobre hielo.
Para preparar la muestra de tejido, diseccione el tejido de aproximadamente 100 miligramos cada uno en una placa de vidrio prelimpiada colocada sobre hielo en una caja de espuma de poliestireno. Transfiera las piezas de tejido a los tubos preparados para la lisis posterior. Para preparar una solución saturada de sulfato de amonio, caliente 500 mililitros de agua destilada doble a 70 grados centígrados.
Mientras se agita, agregue gradualmente polvo de sulfato de amonio hasta que no se disuelva más sulfato de amonio. Enfríe esta solución saturada a temperatura ambiente y guárdela a cuatro grados centígrados durante la noche. Para homogeneizar los tejidos renales porcinos, sonice la suspensión preferiblemente mediante una sonda ultrasónica mientras mantiene la muestra en hielo.
En el caso de los tejidos hepáticos de ratón, use un homogeneizador eléctrico y lávelo regularmente en PBS para evitar la obstrucción mientras mantiene las muestras en hielo. Saque 20 microlitros de las muestras y compruebe bajo el microscopio si las células del tejido homogeneizado se destruyen correctamente. De lo contrario, repita la homogeneización.
Centrifugar los tubos a 10.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Recoge el sobrenadante en un tubo fresco y colócalo sobre hielo. Posteriormente, filtre el sobrenadante utilizando unidades de filtro de jeringa de 0,45 micrómetros y 0,22 micrómetros.
Alícuota el sobrenadante en lotes de 10 mililitros y congélelos a menos 20 grados Celsius para almacenamiento a corto plazo o a menos 80 grados Celsius para un almacenamiento más largo. Prepare una muestra de 50 microlitros para el análisis SDS-PAGE o Western blot agregando 10 microlitros de cinco veces el tampón de muestra SDS a 40 microlitros del sobrenadante y luego hirviendo a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Prepare un gel discontinuo de poliacrilamida SDS-PAGE al 12,5% de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para realizar el análisis SDS-PAGE, cargue los pocillos del gel posteriormente con una escalera de marcadores de proteínas, cinco nanogramos de proteína recombinante FAHD1 humana como control positivo, 20 microlitros de la muestra a analizar y los pozos restantes con 20 microlitros de tampón de muestra SDS-PAGE preparado. Ejecute los geles SDS-PAGE a 125 voltios utilizando el búfer de ejecución SDS. Una vez que se complete SDS-PAGE, realice un análisis de Western blot, sondee las membranas utilizando el anticuerpo disponible contra FAHD1.
Después de preparar las alícuotas sobrenadantes como se describió anteriormente, procese después de la descongelación o procese directamente después de la extracción de proteínas sin congelar la muestra. Filtre la muestra utilizando una unidad de filtro de 0,22 micrómetros para excluir posibles precipitados después de la descongelación. Prepare seis tubos de 1,5 mililitros sobre hielo, luego transfiera 250 microlitros de muestra a cada tubo.
Prepare una serie de dilución de sulfato de amonio en los tubos preparados y componga el volumen final a 1, 000 microlitros con tampón de lisis de proteínas. Incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche en un rotador de tubo. Usando una centrífuga de mesa, centrífuga a 10, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius y transfiera cuidadosamente todos los sobrenadantes en tubos separados.
Seque al aire los gránulos resultantes y vuelva a gastar cada uno de ellos en 1.000 microlitros de agua destilada doble. Para cada par de pellets y sobrenadantes resuspendidos del paso anterior, mezcle 40 microlitros con 10 microlitros de cinco veces el tampón de muestra SDS y hierva a 95 grados Celsius con tapas abiertas hasta que la mayor parte del líquido se haya vaporizado. Luego vuelva a suspender el pellet en una mezcla de 50% de dimetilsulfóxido en agua destilada doble.
Realice SDS-PAGE cargando las muestras derivadas de los pellets resuspendidos y sobrenadante en pares, seguido de un análisis de Western blot. Sin embargo, haga funcionar los geles a 80 voltios durante tres horas. Configure el sistema FPLC con la columna de intercambio aniónico o catiónico.
Lave la columna con cinco volúmenes de columna de etanol al 20% en agua destilada doble, seguido de cinco volúmenes de columna de agua destilada doble. Aplique la muestra sobre la columna, ya sea por inyección o mediante el uso de una bomba de muestra y recoja el flujo. Lave la columna con un volumen de columna del tampón de sal baja.
Configure una elución de gradiente lineal de tampón de sal 100% bajo a tampón de sal 100% alto dentro de tres volúmenes de columna. Recoja continuamente fracciones de un mililitro. Una vez finalizado el gradiente, continúe funcionando con un tampón de sal alto hasta que no se detecten más picos asociados a proteínas en el cromatograma en el rango de un volumen de columna.
Aplique un mililitro de SDS al 25% disuelto en hidróxido de sodio molar 0.5 y agua destilada doble para limpiar la columna. Lave consecutivamente la columna con tres volúmenes de columna de agua destilada doble y tres volúmenes de columna de etanol al 20% en agua destilada doble. Recopile las muestras SDS-PAGE de todas las fracciones máximas y el flujo continuo.
Congele las fracciones recolectadas en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 80 grados centígrados. Después de sondearlos a través de Western blot, descongelar y agrupar las fracciones que contienen las proteínas de interés y desechar las demás. Para realizar el paso de purificación, reduzca el volumen de la solución de proteína a dos mililitros utilizando unidades de filtro de ultra centrifugación.
Filtre secuencialmente la solución con unidades de filtro de jeringa de 0,45 micrómetros y 0,22 micrómetros para eliminar cualquier microprecipitación. Equilibre la columna de cromatografía de exclusión de tamaño con un volumen de columna de tampón en ejecución que contenga un ditiotreitol milimolar. Cargue la muestra en la columna y ejecute la unidad de cromatografía hasta que todas las proteínas se eluyan como se describió anteriormente.
Preparar 50 muestras de microlitros para el análisis SDS-PAGE y Western blot descrito anteriormente. Lave consecutivamente la columna con una columna de volumen de agua destilada doble y una columna de volumen de etanol al 20% en agua destilada doble. Después de realizar el análisis de Western blot, agrupe todas las fracciones que contienen FAHD1.
Reduzca el volumen de la solución proteica a dos mililitros utilizando unidades de filtro de ultra centrifugación. El cribado de Western blot muestra la presencia de FAHD1 porcino en el sobrenadante con una banda a 25 kilodaltons mientras que el control positivo marcado corre a 34 kilodaltons. El FAHD1 porcino del lisado se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico y las proteínas de unión se eliminaron por elución.
Las fracciones que contenían FAHD1 porcino se identificaron mediante análisis de Western blot, agrupadas y concentradas. Las muestras de proteínas fueron purificadas por sec e identificadas por el análisis de Western blot. El rendimiento de la proteína FAHD1 porcina fue de aproximadamente un miligramo con un nivel de pureza del 80%.
El análisis de Western blot detectó la proteína FAHD1 del ratón en el flujo a través junto con otras proteínas. El flujo a través se aplicó para la cromatografía de exclusión de tamaño. Las fracciones que contenían FAHD1 se agruparon, concentraron y aplicaron al análisis SDS-PAGE.
Sin embargo, el rendimiento de proteína no fue muy alto. La actividad enzimática específica de la FAHD1 porcina aumenta con el nivel de pureza al aumentar la cantidad relativa de FAHD1 por proteína total. Las concentraciones más altas de sulfato de amonio causan el efecto sonrisa, que se puede resolver a un voltaje más bajo.
Se encontró proteína adicional en el lisado y el sobrenadante a una concentración del 15%. Sin embargo, a concentraciones más altas, las muestras pueden precipitar y no pueden ser detectadas. El protocolo presentado aquí requiere que la proteína sea solucionable.
Las condiciones óptimas para la precipitación y el pH o el ajuste de tamaño para la cromatografía deben probarse y definirse. El estudio de la función enzimática, la investigación de la estructura de las proteínas y el desarrollo de anticuerpos se apoyan en gran medida cuando se extrae proteína del tejido en lugar de extraerse de las bacterias.
