박테리아로부터 재조합 단백질을 정제하는 것은 잘 확립된 방법이다. 그러나 이러한 기술을 사용할 때 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 조직에서 단백질을 추출하는 방법을 갖는 것은 확실히 매력적입니다.
이 방법의 주요 이점은 그의 폴딩 및 촉매 활성에 영향을 줄 수있는 모든 상호 효과를 포함하여 그의 생리적 형태로 단백질을 추출 할 수 있다는 것입니다. 이러한 접근법은 관심있는 다른 단백질에 적응되고 다른 조직에 대해 변형될 수 있다. 조직으로부터 정제된 단백질은 고품질 항체 및 약리학적 억제제의 개발을 지원할 수 있다.
시작하려면 PBS 250 밀리리터와 50 밀리몰 플루오라이드 나트륨, 밀리몰 페닐메틸설포닐 플루오라이드 한 개, 밀리리터 아프로티닌 당 두 마이크로그램, 및 밀리몰 활성화된 오르토바나데이트 한 개를 혼합하여 단백질 용해 완충액을 준비한다. 용액을 0.22 마이크로미터 시린지 필터 유닛을 사용하여 여과한다. 조직 그램 당 두 밀리리터의 용해 완충액으로 튜브를 준비하고 얼음 위에 놓습니다.
조직 샘플을 제조하기 위해, 폴리스티렌 폼 박스의 얼음 위에 놓인 미리 세척된 유리판 위에 각각 약 100 밀리그램의 조직을 해부한다. 후속 용해를 위해 조직 조각을 준비된 튜브로 옮깁니다. 포화 황산암모늄 용액을 제조하려면 이중 증류수 500 밀리리터를 섭씨 70도까지 가열하십시오.
교반하면서 황산암모늄이 더 이상 용해되지 않을 때까지 황산암모늄 분말을 서서히 첨가한다. 이 포화 용액을 실온으로 식히고 하룻밤 사이에 섭씨 네 도에 보관하십시오. 돼지 신장 조직을 균질화하려면 샘플을 얼음 위에 유지하면서 초음파 프로브로 현탁액을 초음파 처리하는 것이 좋습니다.
마우스 간 조직의 경우, 전기 균질 기를 사용하고 PBS로 정기적으로 세척하여 샘플을 얼음 위에 보관하면서 막힘을 방지하십시오. 샘플에서 20 마이크로 리터를 꺼내 균질화 된 조직의 세포가 제대로 파괴되었는지 현미경으로 확인하십시오. 그렇지 않으면 균질화를 반복하십시오.
튜브를 섭씨 4도에서 30분 동안 10, 000배 G에서 원심분리한다. 상층액을 신선한 튜브에 모아 얼음 위에 놓습니다. 이어서, 상청액을 0.45 마이크로미터 및 0.22 마이크로미터 시린지 필터 유닛을 사용하여 여과한다.
상층액을 10 밀리리터 배치로 분취하여 단기 보관의 경우 영하 20도, 장기간 보관을 위해 영하 80도에서 동결시킵니다. 50 마이크로리터의 SDS 샘플 버퍼를 40 마이크로리터의 상청액에 5배 10 마이크로리터의 상청액을 첨가한 다음, 섭씨 95도에서 10분 동안 끓여서 SDS-PAGE 또는 웨스턴 블롯 분석을 위해 50 마이크로리터 샘플을 준비한다. 제조업체의 지침에 따라 불연속 12.5 % 폴리 아크릴 아미드 SDS-PAGE 젤을 준비하십시오.
SDS-PAGE 분석을 수행하기 위해, 단백질 마커 사다리, 양성 대조군으로서 인간 FAHD1 재조합 단백질의 다섯 나노그램, 분석할 샘플의 20 마이크로리터, 및 20 마이크로리터의 제조된 SDS-PAGE 샘플 버퍼로 나머지 웰을 연속적으로 로딩한다. SDS 실행 버퍼를 사용하여 SDS-PAGE 젤을 125V로 실행합니다. SDS-PAGE가 완료된 후, 웨스턴 블롯 분석을 수행하고, FAHD1에 대해 상승가능한 항체를 사용하여 멤브레인을 프로브한다.
앞서 기술한 바와 같이 상청액 분취량을 준비한 후, 샘플을 동결시키지 않고 해동 후 처리하거나 단백질 추출 직후에 처리한다. 해동 후 가능한 침전물을 배제하기 위해 0.22 마이크로미터 필터 유닛을 사용하여 샘플을 여과한다. 얼음 위에 여섯 개의 1.5 밀리리터 튜브를 준비한 다음 250 마이크로 리터의 샘플을 각 튜브로 옮깁니다.
준비된 튜브에 황산암모늄의 희석 시리즈를 준비하고 단백질 용해 완충액으로 최종 부피를 1, 000 마이크로리터로 구성한다. 샘플을 튜브 회전기 상에서 하룻밤 동안 섭씨 네 도에서 인큐베이션한다. 탁상용 원심분리기를 이용하여 섭씨 4도에서 30분 동안 10, 000배 G에서 원심분리하고 모든 상층액을 별도의 튜브로 조심스럽게 옮긴다.
생성된 펠렛을 공기 건조시키고 이들 각각을 1, 000 마이크로리터의 이중 증류수에 재현탁시킨다. 이전 단계의 재현탁 펠릿 및 상청액의 각 쌍에 대해 40 마이크로 리터를 SDS 샘플 버퍼의 5 배의 10 마이크로 리터와 혼합하고 대부분의 액체가 기화 될 때까지 뚜껑을 열어 섭씨 95도에서 끓입니다. 그런 다음 펠렛을 이중 증류수에 50 % 디메틸 설폭사이드의 혼합물에 재현탁시킨다.
재현탁된 펠릿 및 상청액으로부터 유래된 샘플을 쌍으로 로딩하여 SDS-PAGE를 수행하고, 이어서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그러나 젤을 80 볼트에서 세 시간 동안 실행하십시오. 음이온 또는 양이온 교환 컬럼으로 FPLC 시스템을 설정하십시오.
컬럼을 이중 증류수에서 20% 에탄올의 다섯 컬럼 부피로 세척한 다음, 다섯 컬럼 부피의 이중 증류수로 세척한다. 주입 또는 샘플 펌프를 사용하여 샘플을 컬럼에 적용하고 유동을 수집합니다. 저염 완충액의 하나의 컬럼 부피로 컬럼을 세척한다.
세 컬럼 부피 내에서 100% 저염 완충액에서 100% 고염 완충액으로 선형 구배 용출을 설정합니다. 지속적으로 하나의 밀리리터 분수를 수집합니다. 구배가 끝난 후, 하나의 컬럼 부피의 범위에 걸쳐 크로마토그램에서 더 이상 단백질-관련 피크가 검출되지 않을 때까지 높은 염 완충액으로 계속 실행한다.
0.5 몰 수산화나트륨과 이중 증류수에 용해 된 25 % SDS 한 밀리리터를 적용하여 컬럼을 청소하십시오. 이중 증류수에서 세 개의 컬럼 부피의 이중 증류수와 20 % 에탄올의 세 컬럼 볼륨으로 컬럼을 연속적으로 세척하십시오. 모든 피크 분획 및 유동 스루의 SDS-PAGE 샘플을 수집한다.
스냅은 수집 된 분획을 액체 질소에서 동결시키고 영하 80도에서 보관하십시오. 웨스턴 블롯을 통해 이들을 프로빙한 후, 관심있는 단백질을 포함하는 분획을 해동 및 풀링하고 다른 것들은 버린다. 정제 단계를 수행하려면 울트라 원심분리 필터 장치를 사용하여 단백질 용액의 부피를 두 밀리리터로 줄입니다.
용액을 0.45 마이크로미터 및 0.22 마이크로미터 시린지 필터 유닛으로 순차적으로 필터링하여 임의의 미세침전을 제거한다. 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 하나의 밀리몰 디티오트레이톨을 함유하는 실행 완충액의 하나의 컬럼 부피로 평형화시킨다. 샘플을 컬럼 상에 로딩하고, 이전에 기술된 바와 같이 모든 단백질이 용출될 때까지 크로마토그래피 유닛을 실행한다.
앞서 설명한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 50 마이크로리터 샘플을 준비합니다. 이중 증류수에서 하나의 컬럼 부피의 이중 증류수와 20 % 에탄올의 하나의 컬럼 부피로 컬럼을 연속적으로 세척하십시오. 웨스턴 블롯 분석을 수행한 후, 분획을 함유하는 모든 FAHD1을 풀링한다.
울트라 원심분리 필터 유닛을 사용하여 단백질 용액의 부피를 두 밀리리터로 줄입니다. 웨스턴 블롯 스크리닝은 태그가 지정된 양성 대조군이 34킬로달톤에서 실행되는 동안 25킬로달톤의 밴드를 가진 상청액에 돼지 FAHD1의 존재를 보여줍니다. 용해물로부터 돼지 FAHD1을 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하고, 결합 단백질을 용출에 의해 제거하였다.
돼지 FAHD1을 함유하는 분획은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었고, 풀링되고 농축되었다. 단백질 샘플을 SEC에 의해 정제하고 웨스턴 블롯 분석에 의해 동정하였다. 돼지 FAHD1 단백질의 수율은 80 % 순도의 약 1 밀리그램이었다.
웨스턴 블롯 분석은 마우스 FAHD1 단백질을 다른 단백질과 함께 유동-관통하여 검출하였다. 유동-스루를 크기 배제 크로마토그래피에 적용하였다. FAHD1을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축하고, SDS-PAGE 분석에 적용하였다.
그러나, 단백질의 수율은 그리 높지 않았다. 돼지 FAHD1의 특정 효소 활성은 총 단백질 당 FAHD1의 상대적 양을 증가시킬 때 순도 수준에 따라 증가합니다. 황산 암모늄의 높은 농도는 더 낮은 전압에서 해결 될 수있는 미소 효과를 일으킨다.
추가의 단백질은 15% 농도에서 용해물 및 상청액에서 발견되었다. 그러나 더 높은 농도에서는 샘플이 침전 될 수 있으며 검출 할 수 없습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 단백질이 해결 가능하다는 것을 요구합니다.
크로마토그래피를 위한 침전 및 pH 또는 크기 조정을 위한 최적 조건은 시험되고 정의되어야 합니다. 효소 기능에 대한 연구, 단백질 구조 조사 및 항체 개발은 박테리아에서 추출하기보다는 조직에서 단백질을 추출 할 때 크게 지원됩니다.
