רגישות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית ל-Na⁺ חושפת בריכות CoQ פונקציונליות מפולחות חלקית

פרוטוקול זה מדגיש את תפקידו של הנתרן כשליח שני ומראה גם את קיומן של בריכות יוביקווינול מובחנות חלקית. טכניקה זו מדגימה גישה פשוטה ביותר לחקר מאגרי יוביקווינול אשר אחרת דורשת מודלים ספציפיים מאוד של תאים. גישה זו עשויה לשמש לחקר העברת אלקטרונים בממברנות אחרות, במיוחד של אנזימים בתוך טיפות שומנים.

פצל את הדגימות לארבע תת-דגימות של 20 מיקרוגרם כל אחת ותייג אותן כ-A עד D.פצל את הדגימות A ו-B לשתי תת-דגימות של 10 מיקרוגרם כל אחת ותייג אותן כ-A1, A2, B1 ו-B2. הכן את מאגר C1/C2 כמתואר בפרוטוקול הטקסט וחמם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. בקובטה אחת של מיליליטר, הוסיפו כל אחת מתת-הדגימות ל-30 מיקרוליטרים של ציטוכרום c ו-10 מיקרוליטרים של מלונט. הוסף מאגר C1/C2 כדי להעלות את הנפח ל-980 מיקרו-liters ב-cuvettes A1 ו-B1 ו-979 microliters ב-A2 ו-B2. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של אשלגן כלורי טוחן אחד בקובטות A1 ו-A2 ו-10 מיקרוליטרים של נתרן כלורי טוחן אחד ב-B1 ו-B2. הוסיפו מיקרוליטר אחד של רוטנון מילימולרי אחד לקובטות A2 ו-B2. ממש לפני המדידה, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של NADH 10 מילימולר לכל הקובטות.

הופכים את הקובט שלוש פעמים ומניחים אותו בספקטרופוטומטר. התוכנה המצורפת, לחץ על מדידה ואז פרמטרים, ואז עבור אל כללי והגדר את פרמטרי המדידה באורך גל של 550 ננומטר וזמן בארבע דקות של קריאה. לחץ על אישור והתחל כדי להתחיל בניסוי.

בסוף המדידה, שמרו את השיפוע הכולל את העלייה הליניארית של הספיגה על ידי לחיצה על File ו-Save As.פיצלו דגימות C ו-D לשתי תת-דגימות של 10 מיקרוגרם כל אחת ותייגו אותן כ-C1, C2, D1 ו-D2. מערבבים כל אחת מתת-הדגימות בקובטה של מיליליטר אחד עם 30 מיקרוליטרים של ציטוכרום c ומיקרוליטר אחד של רוטנון. הוסף את מאגר C1/C2 שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס כדי להעלות את הנפח ל-980 מיקרוליטרים ב-cuvettes C1 ו-D1 ו-970 microliters ב-C2 ו-D2. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של אשלגן כלורי טוחן אחד ב-cuvettes C1 ו-C2 ו-10 מיקרוליטרים של נתרן כלורי טוחן אחד ב-D1 ו-D2. הוסיפו מיקרוליטר אחד של אנטימיצין A מילימולרי אחד לתוך הקובטות C2 ו-D2 ממש לפני המדידה ו-10 מיקרוליטרים של סוקסינט טוחן אחד לכל הקובטות. הופכים את הקובט שלוש פעמים ומניחים אותו בספקטרופוטומטר.

בצע את המדידה ושמור את השיפוע הכולל את העלייה הליניארית של הספיגה בסוף המדידה. פרוטוקול זה שימש לחקר ההשפעה של יוני נתרן על הפחתת ציטוכרום c על ידי ממברנות מיטוכונדריאליות על תוספת NADH או סוקסינט. עקבות ספיגה שנוצרו ב-550 ננומטר עבור דגימות A ו-B תוקנו עבור העיכוב המתאים להן.

עקבות אלה הראו שיפוע דומה, המצביע על פעילות דומה של NADH-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז. עם זאת, עקבות לדגימות C ו-D היו שונים, והראו כי פעילות succinate-cytochrome c oxidoreductase של מדגם C גבוהה מזו של מדגם C גבוהה יותר מזו של מדגם D.In סדר כדי לנרמל את כמות השינוי שנמדדה בטכניקה זו, שיטות אחרות יכולות להתבצע עוד יותר, כגון פעילות I מורכבת מבודדת, מורכבת II או מורכבת III. באמצעות טכניקה זו, אנו חוקרים את ההגדרות הפיזיולוגיות שבהן נתרן עשוי להיות מעורב כשליח שני.