מציאת טיפולים לגליובלסטומה היא מאתגרת בגלל המגוון התאי שקיים בגידולים והאינטראקציות בין מיקרו-סביבה מגוונת. אורגנואידים יכולים לעזור לשחזר חלק מהמגוון המרחבי הזה, ואנו יכולים להשתמש בזה כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של הגידולים. בעוד ששיטות מסורתיות של תרביות תאים נוטות לייצר אוכלוסיות תאי גידול הומוגניות, אורגנואידים יכולים לחקות טוב יותר את המגוון המולקולרי והתאי של גליובלסטומה ולמדל טוב יותר אינטראקציות תוך-גופיות.
ניתן להשתמש באורגנואידים כדי לחקור את יעילות התרופה ומנגנוני העמידות. התנגדות לטיפולים קליניים עשויה להופיע רק באורגנואידים ולא בתרבות התחום המסורתית, המשקפת את המציאות הקלינית של מחלה זו. אורגנואידים יכולים לעזור להדגים את ההשפעות האזוריות של כימותרפיה.
ניתן להשתמש בהם כדי לגלות טיפולים ספציפיים חדשים בנישה, והם יכולים גם לשמש ככלי חיזוי לרפואה מותאמת אישית בעתיד. חלק מהחומרים המשמשים ליצירת אורגנואידים רגישים לטמפרטורה, והזנחת השמירה על חומרים אלה בטמפרטורה הנכונה שלהם עלולה להוביל לקשיים ביצירה או בשמירה על אורגנואידים. התחילו להכין את התבניות האורגנואידיות מתחת לקולט אדים על ידי הורדת נייר השעווה מגיליון הפרפילם והצבתו בין שתי תגובות שרשרת פולימראז סטריליות 96-well או לוחות PCR.
ודא כי החלק הפנימי של parafilm נקי. הפעילו לחץ אחיד על הלוח העליון כדי ליצור גומות קטנות בעומק שני מילימטרים בפרפילם מבלי ליצור חורים. מפרידים את הצלחות.
הפרפילם הגומה יידבק לצלחת העליונה. לאחר מכן הניחו את הצלחת העליונה על קרח יבש למשך 30 שניות. השתמש במלקחיים סטריליים כדי למשוך את הפרפילם מהצלחת העליונה בתנועה מהירה.
פרפילם קפוא קל יותר להסרה. מניחים את תבנית הפרפילם שהושלמה בתבנית מכוסה וסטרילית של תרבית תאים באורך 10 סנטימטרים. כדי להכין את ההשעיה החד-תאית מגליובלסטומה או מתרבית דבק GBM, הסר את המדיה המשומשת מהצלחת.
לאחר מכן מוסיפים שני מיליליטר של תמיסת ניתוק תאים בטמפרטורת החדר לצלחת, ודוגרים את הצלחת ב 37 מעלות במשך שלוש דקות. לאחר אישור ניתוק התא מהצלחת מתחת למיקרוסקופ, הוסף שמונה מיליליטר של Neurobasal Medium שלם, או מדיום NBMC, כדי לנטרל את תמיסת ניתוק התא. מסננים את המתלים דרך מסננת תאים אחת של 70 מיקרון.
סובבו את התאים בטמפרטורה של 120 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן להסיר את supernatant ו resushed את התאים במיליליטר אחד של NBMc. לספור את התאים מן ההשעיה של תא יחיד באמצעות כתם impermeant התא.
כדי ליצור אורגנואידים מתרחיף חד-תאי, הוסף כמות מתאימה של מטריצה חוץ-תאית עשירה בלמינין, או lrECM, לתוך צינור צנטריפוגה קטן בדלי קרח או בלוק קר. הכן תערובת תאים המכילה 20, 000 תאים לכל organoid. ערבבו היטב את תערובת תרחיף התאים lrECM כדי למנוע התיישבות של התאים, מה שיגרום להיווצרות אורגנואידית לא אחידה.
לאחר מכן, פיפטה בזהירות 20 מיקרוליטר של התערובת על תבנית parafilm כדי ליצור טיפה דמוית פנינה. הקפידו לקרר את קצה הפיפטה כל שניים עד שלושה אורגנואידים כדי למנוע פילמור lrECM. לאחר שמספר האורגנואידים הרצוי יונף על תבנית הפרפילם בצלחת תרבית באורך 10 סנטימטרים, דגרו את האורגנואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים באינקובטור של תרבית תאים.
לאחר שהאורגנואידים מתמצקים, שטפו את האורגנואידים בעדינות מתבנית הפרפילם עם מדיום NBMc באמצעות קצה P1000 ואספו אותם לצלחת תרבית חדשה באורך 10 ס"מ המכילה 20 מיליליטר של NBMc. מניחים את צלחת התרבית באינקובטור מבלי לרעוד במשך ארבעה ימים. לאחר ארבעה ימים, החלף את המדיה בצלחת.
לשם כך, הניחו פיסת נייר כהה מתחת לצלחת תרבית התא. הטה את הצלחת והמתן 20 שניות. כאשר האורגנואידים מתיישבים לחלוטין בתחתית המנה, מסירים באיטיות את המדיה עם פיפטה זכוכית גדולה הנפתחת.
לאחר הוספת מדיה חדשה, מניחים את הצלחת באינקובטור על שייקר מסלולי ב-80 סל"ד, ומחליפים מדיה כל יומיים-שלושה לאחר מכן. הצמיחה של האורגנואיד נצפתה באמצעות מיקרוסקופ אור. במבט המרכזי, גידול אורגנואידים מוקדם הראה נדידה ופלישה חד-תאית דרך lrECM.
האורגנואידים הבוגרים בגיל שבעה שבועות היו יחסית לגודל של אגורה. הכתם האימונוהיסטוכימי של האורגנואידים GBM עם פוספו-היסטון H3 חשף תאים מתרבים מאוד עם מראה חום או סגול בהיקף האורגנואידי בהשוואה לליבה. נתוני הכדאיות של התאים עבור אורגנואידים ב-0.1% DMSO הדגימו עקביות תוך-אורגנית ואינטראורגנידית.
שימו לב לביומסה אורגנואידית ולהחמצת מדיה. אם האורגנואידים עוברים מדיה מהר מדי, הקפד להחליף את המדיה בתדירות גבוהה יותר או לפצל את האורגנואידים בין צלחות נוספות. אורגנואידים בוגרים יכולים לשמש לניסויים עם טיפולים או מוטבעים ומחולקים לשימוש עם אימונוהיסטוכימיה או אימונופלואורסצנציה.
ניתן להשתמש באורגנואידים מנותקים לניתוח FACS. אורגנואידים אלה שימשו לאחרונה בבדיקות תפקודיות תלת-ממדיות כדי לגלות מטרות חיוניות בנישות של תאי גזע סרטניים מובחנים מרחבית. אנחנו גם משתמשים במודלים האלה כדי לתעדף תרופות וטיפולים שונים לפני בדיקות in vivo.
