膠芽腫の治療法を見つけることは、腫瘍に存在する細胞の多様性と多様な微小環境間の相互作用のために困難です。オルガノイドは、その空間的多様性の一部を再現するのに役立ち、これを使用して腫瘍の生物学をよりよく理解することができます。従来の細胞培養法は均質な腫瘍細胞集団を生成する傾向がありますが、オルガノイドは膠芽腫の分子および細胞の多様性をよりよく模倣し、腫瘍内相互作用をより適切にモデル化できます。
オルガノイドは、薬効や耐性のメカニズムを調べるために使用できます。臨床療法に対する耐性は、オルガノイドにのみ現れ、伝統的な領域培養には現れず、この病気の臨床的現実を反映しています。オルガノイドは、化学療法の局所的効果を実証するのに役立ちます。
それらは、新しいニッチな特定の治療法を発見するために使用でき、将来の個別化医療の予測ツールとしても機能します。オルガノイドの作成に使用される一部の材料は温度に敏感であり、これらの材料を適切な温度に保つことを怠ると、オルガノイドの作成または維持が困難になる可能性があります。パラフィルムシートからパラフィン紙を取り出し、2つの滅菌96ウェルポリメラーゼ連鎖反応またはPCRプレートの間に置いて、培養フードの下でオルガノイドモールドの準備を開始します。
パラフィルムの内側がきれいであることを確認してください。天板に均等な圧力を加えて、穴を開けずにパラフィルムに深さ2ミリメートルの小さなディンプルを形成します。プレートを分離します。
くぼみのあるパラフィルムは天板にくっつきます。次に、トッププレートをドライアイスの上に30秒間置きます。滅菌鉗子を使用して、パラフィルムをトッププレートから素早く引き抜きます。
冷凍パラフィルムは取り外しが簡単です。完成したパラフィルム型を、蓋をした滅菌済みの10センチメートルの細胞培養皿に入れます。膠芽腫またはGBM付着培養物から単一細胞懸濁液を調製するには、使用済みの培地をプレートから取り出します。
次に、室温で2ミリリットルの細胞剥離溶液をプレートに加え、プレートを37度で3分間インキュベートします。顕微鏡下でプレートからの細胞剥離を確認した後、8ミリリットルのニューロバクサル培地(NBMc培地)を加えて細胞剥離液を中和します。単一の70ミクロンセルストレーナーを通して懸濁液を濾します。
セルを120倍Gで5分間スピンダウンします。次に上清を除去し、細胞を1ミリリットルのNBMcに再懸濁します。 細胞不透過性染色剤を使用して単一細胞懸濁液から細胞をカウントします。
シングルセル懸濁液からオルガノイドを作製するには、適量のラミニンリッチ細胞外マトリックス(lrECM)をアイスバケットまたはコールドブロックの小さな遠心チューブに加えます。オルガノイドあたり20, 000個の細胞を含む細胞混合物を調製します。lrECM細胞懸濁液混合物を十分に混合して、細胞が沈降しないようにし、その結果、オルガノイドが不均一に形成されます。
次に、20マイクロリットルの混合物をパラフィルム型上に注意深くピペットで入れ、真珠様の液滴を形成した。lrECM重合を防ぐために、2〜3個のオルガノイドごとにピペットチップを冷却してください。必要な数のオルガノイドを10cmの培養プレートのパラフィルム型にピペットで移したら、細胞培養インキュベーター内で37°Cで1〜2時間インキュベートします。
オルガノイドが固まったら、P1000チップを使用してNBMc培地でパラフィルムモールドからオルガノイドを静かに洗い流し、20ミリリットルのNBMcを含む新しい10センチメートルの培養プレートに回収します。 培養プレートを4日間振とうせずにインキュベーターに入れます。4日後、プレート内のメディアを交換します。
これを行うには、細胞培養プレートの下に暗い紙を置きます。プレートを傾けて20秒待ちます。オルガノイドが皿の底に完全に落ち着いたら、大きな開口部のガラスピペットでゆっくりと培地を取り除きます。
新しい培地を追加した後、プレートを80RPMのオービタルシェーカーのインキュベーターに入れ、その後2〜3日ごとに培地を交換します。オルガノイドの成長は、光学顕微鏡を用いて観察した。中央図では、初期のオルガノイド増殖は、lrECMを介した遊走と単一細胞浸潤を示した。
7週目の成熟オルガノイドは、10セント硬貨の大きさに対して相対的であった。GBMオルガノイドをホスホヒストンH3で免疫組織化学的に染色したところ、コアと比較してオルガノイドの周囲に茶色または紫色の外観を持つ高増殖細胞が明らかになりました。0.1%DMSO中のオルガノイドの細胞生存率データは、オルガノイド内およびオルガノイド間の一貫性を示しました。
オルガノイドバイオマスと培地の酸性化に注意してください。オルガノイドの培地通過が速すぎる場合は、培地をより頻繁に交換するか、追加のプレート間でオルガノイドを分割してください。成熟オルガノイドは、治療法の実験に使用したり、免疫組織化学または免疫蛍光で使用するために埋め込まれて切断することができます。
解離したオルガノイドは、FACS分析に使用できます。これらのオルガノイドは最近、空間的に異なる癌幹細胞ニッチに不可欠な標的を発見するための3次元機能スクリーニングに使用されました。また、これらのモデルを使用して、in vivoテストの前にさまざまな薬剤や治療法に優先順位を付けています。
