Encontrar tratamentos para glioblastoma é um desafio devido à diversidade celular que existe nos tumores e às interações entre diversos microambientes. Organoides podem ajudar a recriar um pouco dessa diversidade espacial, e podemos usar isso para entender melhor a biologia dos tumores. Enquanto métodos tradicionais de cultura celular tendem a produzir populações de células tumorais homogêneas, os organoides podem imitar melhor a diversidade molecular e celular do glioblastoma e melhores interações intratumorais.
Organoides podem ser usados para investigar a eficácia da droga e mecanismos de resistência. A resistência às terapias clínicas só pode aparecer em organoides e não na cultura tradicional da esfera, refletindo a realidade clínica desta doença. Organoides podem ajudar a demonstrar os efeitos regionais das quimioterapias.
Eles podem ser usados para descobrir novas terapias específicas de nicho, e também podem atuar como uma ferramenta preditiva para a medicina personalizada no futuro. Alguns materiais usados para criar organoides são sensíveis à temperatura, e deixar de manter esses materiais em sua temperatura adequada pode levar a dificuldades de criação ou manutenção de organoides. Comece a preparar os moldes organoides sob uma capa de cultura tirando o papel de cera da folha de parafilm e colocando-o entre duas estéreis reações de corrente de polimerase de 96 poços ou placas PCR.
Certifique-se de que o interior do parafilme está limpo. Aplique até pressão na placa superior para formar pequenas covinhas de dois milímetros de profundidade no parafilme sem criar furos. Separe as placas.
O parafilme dimpled vai ficar na placa superior. Em seguida, coloque a placa superior em gelo seco por 30 segundos. Use fórceps estéreis para puxar o parafilm da placa superior em um movimento rápido.
Parafilm congelado é mais fácil de remover. Coloque o molde de parafilme completo em um prato de cultura celular coberta e estéril de 10 centímetros. Para preparar a suspensão unicelular da cultura aderente ao glioblastoma ou GBM, remova a mídia usada da placa.
Em seguida, adicione dois mililitros de solução de descolamento celular à temperatura ambiente à placa, e incubar a placa a 37 graus por três minutos. Após confirmar o descolamento celular da placa sob o microscópio, adicione oito mililitros de Neurobasal Medium completos, ou meio NBMc, para neutralizar a solução de descolamento celular. Coe a suspensão através de um único coador de células de 70 mícrons.
Gire as células a 120 vezes g por cinco minutos. Em seguida, remova o supernatante e resuspende as células em um mililitro de NBMc. Conte as células da suspensão unicelular usando uma mancha impermeável celular.
Para fazer organoides a partir de uma suspensão de célula única, adicione uma quantidade apropriada de matriz extracelular rica em laminina, ou 1ECM, em um pequeno tubo de centrífuga em um balde de gelo ou bloco frio. Prepare uma mistura celular contendo 20.000 células por organoide. Misture bem a mistura de suspensão celular LrECM para evitar a fixação das células, o que resultaria em formação organoide não uniforme.
Em seguida, pipeta cuidadosamente 20 microliters da mistura em um molde de parafilme para formar uma gota semelhante a pérola. Certifique-se de esfriar a ponta da pipeta a cada dois ou três organoides para evitar a polimerização do 1ECM. Uma vez que o número desejado de organoides são pipetados no molde de parafilme em uma placa de cultura de 10 centímetros, incubar os organoides a 37 graus Celsius por uma a duas horas em uma incubadora de cultura celular.
Depois que os organoides forem solidificados, tire os organoides suavemente do molde de parafilme com o meio NBMc usando uma ponta P1000 e colete-os em uma nova placa de cultura de 10 centímetros contendo 20 mililitros de NBMc. Coloque a placa de cultura em uma incubadora sem tremer por quatro dias. Depois de quatro dias, substitua a mídia na placa.
Para fazer isso, coloque um pedaço de papel escuro sob a placa de cultura celular. Incline a placa e espere por 20 segundos. À medida que os organoides se acomodam completamente na parte inferior do prato, lentamente remova a mídia com uma pipeta de vidro de abertura grande.
Depois de adicionar novas mídias, coloque a placa na incubadora em um agitador orbital a 80 RPM, e troque a mídia a cada dois ou três dias depois. O crescimento do organoide foi observado por meio de microscopia leve. Na visão central, o crescimento organoide precoce mostrou migração e invasão unicelular através do IrECM.
Os organoides maduros com sete semanas eram relativos ao tamanho de um centavo. A coloração imunohistoquímica dos organoides GBM com fosfo-histona H3 revelou células altamente proliferativas com uma aparência marrom ou roxa no perímetro organoide em comparação com o núcleo. Os dados de viabilidade celular para organoides em 0,1% DMSO demonstraram consistência intraorganoide e interorganóide.
Preste atenção à biomassa organoide e à acidificação da mídia. Se os organoides estiverem passando pela mídia muito rapidamente, certifique-se de trocar a mídia com mais frequência ou dividir os organoides entre placas adicionais. Organoides maduros podem ser usados para experimentos com terapias ou incorporados e seccionados para uso com imunohistoquímica ou imunofluorescência.
Os organoides dissociados podem ser usados para análise FACS. Esses organoides foram recentemente usados no rastreamento funcional tridimensional para descobrir alvos essenciais em nichos de células-tronco de câncer espacialmente distintos. Também estamos usando esses modelos para priorizar diferentes medicamentos e terapias antes dos testes in vivo.
