寻找胶质母细胞瘤的治疗方法具有挑战性,因为肿瘤中存在的细胞多样性以及不同微环境之间的相互作用。类器官可以帮助重建一些空间多样性,我们可以用它来更好地了解肿瘤的生物学。虽然传统的细胞培养方法倾向于产生均质的肿瘤细胞群,但类器官可以更好地模拟胶质母细胞瘤的分子和细胞多样性,并更好地模拟肿瘤内相互作用。
类器官可用于研究药物疗效和耐药机制。对临床治疗的耐药性可能只出现在类器官中,而不出现在传统的球体培养中,反映了这种疾病的临床现实。类器官可以帮助证明化学疗法的区域效应。
它们可用于发现新的利基特定疗法,也可以作为未来个性化医疗的预测工具。一些用于制造类器官的材料对温度敏感,忽视将这些材料保持在适当的温度会导致难以创建或维护类器官。通过将蜡纸从封口膜片上取下并将其放置在两个无菌 96 孔聚合酶链反应或 PCR 板之间,开始在培养罩下制备类器官模具。
确保封口膜内部清洁。对顶板施加均匀的压力,在封口膜上形成两毫米深的小酒窝,而不会产生孔洞。将盘子分开。
凹陷的封口膜会粘在顶板上。然后将顶板放在干冰上 30 秒。使用无菌镊子快速将封口膜从顶板上拉下。
冷冻封口膜更容易去除。将完成的封口膜模具放入有盖的无菌 10 厘米细胞培养皿中。为了从胶质母细胞瘤或GBM贴壁培养物中制备单细胞悬液,请从平板上除去用过的培养基。
然后在室温下向平板中加入两毫升细胞分离溶液,并将板在37度下孵育3分钟。在显微镜下确认细胞从平板上脱离后,加入8毫升完全神经基础培养基或NBMc培养基以中和细胞分离溶液。通过单个70微米细胞过滤器过滤悬浮液。
以 120 倍 G 的速度旋转细胞五分钟。然后除去上清液并将细胞重悬于一毫升NBMc中。 使用细胞非渗透染色剂计数单细胞悬液中的细胞。
为了从单细胞悬浮液制备类器官,将适量的富含层粘连蛋白的细胞外基质或lrECM添加到冰桶或冷块中的小离心管中。制备每个类器官含有20, 000个细胞的细胞混合物。彻底混合lrECM细胞悬液混合物,以避免细胞沉降,从而导致类器官形成不均匀。
接下来,小心地将 20 微升混合物移液到封口膜模具上,形成珍珠状液滴。确保每两到三个类器官冷却移液器吸头,以防止lrECM聚合。将所需数量的类器官移液到10厘米培养板中的封口膜模具上后,将类器官在37摄氏度下在细胞培养箱中孵育一至两个小时。
类器官固化后,使用P1000尖端用NBMc培养基轻轻冲洗类器官从封口膜模具上,并将它们收集到含有20毫升NBMc的新10厘米培养板中。 将培养板放入培养箱中,不摇晃四天。四天后,更换板中的培养基。
为此,在细胞培养板下方放置一张深色纸。倾斜盘子并等待 20 秒。当类器官完全沉降在培养皿底部时,用大开口玻璃移液管慢慢取出培养基。
添加新培养基后,将板放入培养箱中,以80 RPM的轨道振荡器,此后每两到三天更换一次培养基。使用光学显微镜观察类器官的生长。在中心视图中,早期类器官生长显示通过lrECM迁移和单细胞侵袭。
七周时的成熟类器官相对于一角硬币的大小。用磷酸化组蛋白H3对GBM类器官进行免疫组织化学染色,显示与核心相比,类器官周边具有棕色或紫色外观的高度增殖细胞。0.1%DMSO中类器官的细胞活力数据表明类器官内和类器官间的一致性。
注意类器官生物量和培养基酸化。如果类器官通过培养基的速度太快,请务必更频繁地更换培养基或在附加板之间拆分类器官。成熟的类器官可用于治疗实验,或包埋和切片以用于免疫组织化学或免疫荧光。
解离的类器官可用于FACS分析。这些类器官最近被用于三维功能筛选,以发现空间上不同的癌症干细胞生态位中必不可少的靶标。我们还使用这些模型在体内测试之前优先考虑不同的药物和疗法。