ק.א. ו-AC נתמכים על ידי מענק ו מלגה מאיגוד הלב האמריקני. SIB ו RB הם נתמך על ידי מענקים NIH.

<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/SOHA_overview.pdf">לחץ כאן כדי להציג סקירה של ההליך חצי אוטומטיות ניתוח (סוהא) דופק.</a> חצי אוטומטיות דופק אופטי ניתוח 1. Preprocess - צעד זה מספק מידע על בקטרים ​​לב סיסטולי ודיאסטולי ו. שולי לב מזוהים ומסומנים במהלך דיאסטולה התכווצות מקסימלית. הקלטות אופטי ניתן מתקדמת במהירות איטית אפילו מסגרת אחת בכל פעם, המאפשר זיהוי מדויק של מסגרות שבו התכווצות הרפיה מירבית של הלב להתרחש. זוג אחד של סימני זיהוי קצוות הדיאסטולי וזוג אחד לזהות את הקצוות סיסטולי נעשים. מרקס יכול גם להתבצע לשכפל במקומות שונים לאורך אופקי הלב. בקטרים ​​הלב שהושגו בשלב זה משמשים גם כדי לחשב מדידה נוסף המספק אומדן contractility הלב. צעד זה הוא קיצור אחוזים חלקיים (% FS) והוא מייצג את המידה בה את הקצוות לב לנוע לכיוון אחד את השני במהלך התכווצות. הנוסחה המשמשת לחישוב FS% הוא: (((בקוטר הדיאסטולי - קוטר הסיסטולי) / בקוטר הדיאסטולי) x 100) הערה - נקודות לזהות קבוצה זו משמשים רק בקוטר מדידות קיצור חלקיים ולא משמשים לזיהוי תנועה. דוגמה: (. Cammarato, et al 2008) ב תסיסנית, מוטציות נקודתיות בתחום מתמר שרשרת שרירן כבד, אזור הידוע לווסת את הפעילות האנזימטית של המנוע, התוצאה בלב כי הם מורחבים או מוגבלת בהתאם אם הם לדכא או לשפר ATPase של שרירן פעילות . סוגים אלה של מדידות לא יכול להתבצע זבובים שלם כפי שהוא בדרך כלל לא ניתן לזהות קצוות לב לכל אורך הצינור לב דרך לציפורן לבין שומן, (השוו Wildtype, D45 ו Mhc5 M-מצבי &quot;M-mode איור &quot;להלן) אשר בדרך כלל מקיפים את הלב. מדידות שנעשו כאשר לדמיין את הלב אצל זבובי שלם עם השיטות הננקטות בדרך כלל אחרים מוגבלים בדרך כלל לחלק הקדמי ביותר של הלב, באזור תא חרוטי. זה גם לא ניתן להשיג מדידה דינמית ברקמות קבוע. 2. התנועה איתור- צעד זה נעשה באופן אוטומטי על ידי התוכנית משתמשת בשני אלגוריתמים שונים כדי לנתח את התנועה בסרט אחד. בקיצור, האלגוריתם הראשון, &quot;מסגרת ממוצע וחושך&quot; אלגוריתם משתמשת מסגרת מסגרת על ידי גישה. זה ממוצעים אלגוריתם עוצמת חושך מסגרת סרט שלם, מנרמל את הערך מרווח בין 0 ל -1, ומגרשים הממוצע מנורמל עבור כל מסגרת בסרט לאורך זמן. הגישה השנייה, את &quot;פיקסל פיקסל על ידי&quot; אלגוריתם, מנתחת את השינוי החושך של כל פיקסלים בודדים ממסגרת אחת לאחרת. פיקסלים כי התערוכה שינויים בעוצמה מעל סף שנקבע מראש מסוכמים עבור כל מסגרת ו זממו עבור כל מסגרת בסרט לאורך זמן. 3. בדוק מרווחי- הפלט משני אלגוריתמים לזיהוי תנועה מוצג מודול זה עם פלט &quot;ממוצע וחושך&quot; מוצג בחלון מעל &quot;פיקסל בפיקסל&quot; חלון הפלט. על מנת להיות בטוח כי מרווחי זיהוי מסכים עם התנועה בסרט בפועל אנו מציגים יתרון-זכר או M-mode עשה מן המסגרות להיות מנותח ישירות מתחת לחלונות פלט האלגוריתם. M-mode נעשית על ידי חיתוך פרוסות דיגיטלית ברוחב פיקסל אחד דרך הלב של כל מסגרת בסרט והתאמת אותם אופקית כדי לספק תמונת מצב של קצה תנועות הלב לאורך זמן. ב &quot;פיקסל בפיקסל&quot; חלון במרווחים הדיאסטולי מזוהה מסומנים על ידי קו אופקי ירוק עם מספר מסגרות לתרום מרווח ישירות מעל. מרווחי הסיסטולי מזוהים מרווח בין שני diastoles רצופים. ההתחלה של התכווצות מצוין במצב-M על ידי קו כחול אנכי, ואת הקצה מסומן על ידי קו אדום אנכי. עם צג זה קל יחסית לראות אם הפלט אלגוריתם מסכים עם תנועות הלב בפועל. למרות זיהוי התנועה מתבצע באופן אוטומטי פלט חייב להיבדק על הדיוק. ישנן מספר סיבות לכך: אחת היא שיש לעתים קרובות תנודות הבסיסית, גל איטי ברמות אור לא קשור לתנועה לב. בדרך כלל ניתן לבטל על ידי שימוש במסנן בנה לעבור גבוהה. סיבה שנייה קשורה לרגישות של &quot;פיקסל בפיקסל&quot; הגישה. פלט האלגוריתם הזה הוא בדרך כלל two עקבות תנועה, אחת לכל תנועת התכווצות ואחד התנועה הרפיה. ב זבובים ישנים ב מוטנטים כמה משך הזמן בין שתי התנועות<html> הופך להיות ארוך יחסית התוכנית מנסה לפרש את שתי התנועות כשתי פעימות נפרדות. זה ניתן לתקן על ידי לשאול את תוכנית להשוות את הפלט של פיקסל על ידי אלגוריתם פיקסל עם זה של האלגוריתם פריים ממוצע חושך, על ידי לחיצה על תיבת &quot;השתמש חושך&quot;. דוגמה (ראה וידאו): בשבוע 5-7 הישן הזבובים במרווחים הסיסטולי הם בדרך כלל הרבה יותר מאשר אצל זבובי צעירים. מרווחי זמן אלה מזוהים בתחילה כמו שני צירים נפרדים המופרדים דיאסטולה קצר. זה ניתן לתקן על ידי בחירת &quot;חושך שימוש&quot; תיבת הסימון. במקרה זה התוכנית יהיה להשוות את מרווח הדיאסטולי שזוהו על ידי Pixel על ידי אלגוריתם פיקסל עם הפלט מסגרת ממוצע החושך. אם התפוקה הממוצעת חושך מסגרת בעלת ערך חיובי, אז מרווח כלשהו הדיאסטולי שזוהו על ידי אלגוריתם פיקסל פיקסל תתעלם ואת מרווחי יפורטו כראוי. הסרט כולו ניתן לסרוק 10 קטעים השני קיבל (לחץ על &quot;נתונים על אישור&quot;) או לדחות (לחץ על &quot;מחק נתונים&quot;). היי ורגישויות Lo לעבור מסנן ניתן להתאימם באופן ידני כדי לסייע באופן מדויק יותר להגדיר מרווחי התכווצות כאשר העסקת אלגוריתם החושך. 4. פלט לסטטיסטיקה, לאחר פלט עבור סרט נתון התקבל התוכנית יהיה להשתמש במידע זה כדי לחשב באופן אוטומטי מספר פרמטרים. אלה כוללים מרווח הסיסטולי והדיאסטולי ו, פרק לב קצב הלב, כיוון ומהירות של FS גל התכווצות, בקטרים ​​לב,%. בנוסף, התוכנית כוללת מספר שיטות לכימות arrhythmicity המשקף לא אחידה התכווצות מחזורי הרפיה (ראה פינק et al, 2009). פלט סטטיסטיים מסופק כל סרט בנפרד עבור הנתונים כולו להגדיר בצורה של ערך מופרד בפסיק (. Csv) אשר ניתן לפתוח תוכניות גיליון אלקטרוני כגון Microsoft Excel. לוח 1 - <img src="/files/ftp_upload/1435/1435table1.jpg" alt="טבלה 1" /> דוגמה הפלט שנוצר על ידי תוכנית חצי אוטומטיות אופטיות ניתוח לב. 5. עדכון Histograms- חלק זה של התוכנית מציגה את כל הנתונים על מרווחי לב עבור בסיס הנתונים בפורמט היסטוגרמה. מאז קצב הלב משתנה ואנחנו לנרמל את נתוני התפוקה היסטוגרמה. עם זאת, כי חלוקת רווחי אינו סימטרי סביב ממוצע נשתמש ערך המרווח הממוצע לנורמליזציה שלנו. דוגמה (ראה וידאו): זבובים כי הם מוטנטים ערוץ אשלגן KCNQ להראות במרווחים הסיסטולי והדיאסטולי ואת סדיר מאוד. בדרך כלל את המרווחים הסיסטולי הם הרבה יותר סדיר יותר מאשר בגיל בהתאמה זבובים wildtype. זה יכול להיראות בבירור על ידי הצגת הנתונים בתבנית היסטוגרמה (ראה גם Ocorr et al. 2007). 6. M-mode- מודול זה מייצר M-מצבי שיכולה להתבצע מתוך עמדה לאורך כל הלב במסגרת הסרט. אורכו של מצב-M יכול להיות גם מוגדר. M-מצבי מועילים כדי להראות איכותית מה הלב עושה בסרט. דוגמה (ראה וידאו): סרט של הלב 3 יום דג הזברה הישן הזחל מראה את החדר הקדמי המשמש ליצור M-mode. פרוסה אנכי של פיקסלים זה יהיה נכרת אלקטרונית ממסגרת כל סרט מצוין על ידי קו אדום. M-mode איור: דוגמאות של M-מצבי מ תסיסנית ו דג הזברה. אחת המוטציות שרירן דנו בתוצאות צעד Preprocess ב מנוע מולקולרי עם קינטיקה האנזים מהיר יותר וכתוצאה מכך הגבלה הלב ומדי פעם בלוק הולכה. פרמטרים אלו יכולים להיות מוצגים איכותית באמצעות M-מצבי. <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig1.jpg" alt="M-מצבי דוגמאות" /> M-מצבי עשה בחלק זהה של הלב ב wildtype וגם זבובים מוטנטיים מראים בבירור את הפנוטיפ הוגבלה MHC 5 מוטציה לבין בקטרים ​​מורחבים מחזורי ההתכווצות arrhythmic של D45 מוטציה (המבטא שרירן עם קינטיקה אנזים מדוכא) (שונה מ Cammarato et. al, 2008). M-mode עשוי מלב הזחל דג הזברה מראה את החדר הקדמי (קולנוע לב כמו שמוצג ההפגנה, פינק et.al. 2009). 7. Red Dot-Movie מודול זה מייצר באופן אוטומטי האט (01:04), 20 הגירסה השנייה של הסרט מראה ניתחו את כל הפיקסלים המזוהות שינוי באדום. תכונה זו משמשת בעיקר לצורכי המחשה. סרט 1 - &quot;סרט נקודה אדומה&quot; מראה את פיקסלים כי מזוהים כבעלי עוצמת השינויים חושך ידי אלגוריתמים תוכנית באדום. מהירות הסרט היא האטה מהמקור בפקטור של 4. w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi &quot;&gt; לחץ כאן כדי להוריד סרט 1. 8. יישומים נוספים, התחלנו ליישם את מערכת אנליטי סרטים במהירות גבוהה של דגמים אחרים עם לבבות קטנים אשר לעתים קשה לנתח באמצעות המתודולוגיה המסורתית. יש לנו מיושם בהצלחה את הניתוח הזה על שני לבבות הזחל דג הזברה ולבבות עכבר עובריים (פינק et al, 2009). סרט 2 - לב עכבר הסרט פלוס דמות עם מרווחי לבדוק עם פלט נתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/Mouse%20heart%20clip%201.avi">לחץ כאן כדי להוריד סרט 2.</a> <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig2.jpg" alt="בדוק הלב מרווחי עכבר" />

<ol>
	<li>Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).</li><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -. S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging.">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li><li>Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+detection+and+quantification+of+heartbeat+parameters+in+Drosophila,+zebrafish+and+embryonic+mouse+hearts.">A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts.</a> Biotechniques. 46, 101-113 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

המודל תסיסנית הוכיחה להיות כלי רב עוצמה גנטי, שבו נעשה שימוש כדי לענות על מגוון שאלות מדעיות החל ההתפתחות העוברית על למידה וזיכרון. לאחרונה אורגניזם מודל זה צדדי נעשה שימוש כדי לחקור את הגנטיקה של תפקוד הלב. מספר נסיונות לכמת הפיזיולוגיה הלב המבוגר תסיסנית הסתמכו על ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MatLab software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Math Works, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required environment for the analysis software.</td>
</tr>
<tr>
<td>EM-CCD digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>9100 or 9300</td>
<td>Other high speed digital cameras will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>HC image data capture software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Other image capture software that produces movies in avi format will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Light Microscope with 10x objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

semi-automated optical heartbeat analysis of small hearts

פיתחנו שיטה לניתוח הקלטות מהירות גבוהה אופטי מ<em&gt; תסיסנית</em&gt;, דג הזברה ולבבות עובריים בעכבר (פינק, et. Al. 2009). ניתוח חצי אוטומטי שלנו Heartbeat אופטי (סוהא) משתמשת התנועה רומן איתור אלגוריתם זה מסוגל לזהות תנועות הלב הקשורים כויץ בודדים ואירועים הרפיה. התוכנית מספקת מגוון רחב של פיזיולוגית readouts הרלוונטיים כולל סיסטולי ודיאסטולי במרווחים, קצב הלב, כמו גם צעדים איכותי וכמותי של arrhythmicity דופק. התוכנית גם מחשבת קוטר מדידות לב במהלך תרויח וגם התכווצות שממנו קיצור השבר ושינויים אזור השבר מחושבים. פלט מסופק כקובץ דיגיטלי תואם תוכניות גיליון אלקטרוני ביותר. המדידות נעשות עבור כל פעימת לב ברשומה הגדלת כוח סטטיסטיות של התפוקה. אנו מדגימים כל הצעדים שבהם קלט משתמש נדרש להראות את היישום של המתודולוגיה שלנו כדי ניתוח של תפקוד הלב בכל שלושת הדגמים לב ממושמע מבחינה גנטית.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts at JoVE.com

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

פיתחנו חצי אוטומטיות Heartbeat אופטי ניתוח בשיטה (סוהא) לניתוח הקלטות מהירות גבוהה אופטי מ<em&gt; תסיסנית</em&gt;, דג הזברה ולבבות עובריים בעכבר. אנו להדגים את היישום של המתודולוגיה שלנו לניתוח של תפקוד הלב זבוב הפירות ולבבות עכבר עובריים.

חצי אוטומטיות Heartbeat ניתוח אופטי של לבבות קטנים

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

semi-automated-optical-heartbeat-analysis-of-small-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  The Sanford Burnham Institute for Medical Research. פיתחנו חצי אוטומטיות Heartbeat אופטי ניתוח בשיטה (סוהא) לניתוח הקלטות מהירות גבוהה אופטי מ תסיסנית, דג הזברה ולבבות עובריים בעכבר. אנו להדגים את היישום של המתודולוגיה שלנו לניתוח של תפקוד הלב זבוב הפירות ולבבות עכבר עובריים.

Video: Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

טיפול ניקוי נאות של המיקרוסקופ

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

הרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ אור

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

דור מצע לEndonucleases של מערכות CRISPR / קאש

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: תוסף ImageJ למדידת צורת עלה חצי אוטומטית

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

בידוד של קרדיומיוציטים מלבבות קבועים עבור אימונוציטוכימיה וניתוח פלוידי

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not only attributed to the normal variability of cells, but also to the differences in methods and models of cell response. Here, an integrated protocol using optical tweezers and defocusing microscopy is employed to obtain the rheological features of red blood cells in the frequency range of 1 Hz to 35 Hz. While optical tweezers are utilized to measure the erythrocyte-complex elastic constant, defocusing microscopy is able to obtain the cell height profile, volume, and its form factor a parameter that allows conversion of complex elastic constant into complex shear modulus. Moreover, applying a soft glassy rheology model, the scaling exponent for both moduli can be obtained. The developed methodology allows to explore the mechanical behavior of red blood cells, characterizing their viscoelastic parameters, obtained under well-defined experimental conditions, for several physiological and pathological conditions.

Here, an integrated protocol based on optical tweezers and defocusing microscopy is described to measure the rheological properties of cells. This protocol has wide applicability in studying the viscoelastic properties of erythrocytes under variable physio-pathological conditions.

ניתוח כמותי של תכונות ויסקו-אלסטיות של תאי דם אדומים באמצעות פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...