פרוטוקול זה יכול לשמש להערכת שלמות ופלסטיות של צומת נוירומוסקולרי בתנאים נורמליים ופתולוגיים. טכניקה זו היא לתייג בו זמנית את תאי שוואן ואת בעלי החיים לפני ואחרי המעבדה על חלקי שריר בודדים. לאחר המתת החולדה הזכרית הבוגרת, הניחו את החולדה במכסה המנוע ופתחו את חלל בית החזה כדי לגשת ללב באמצעות מספריים ומלקחיים.
מחדירים קטטר תוך ורידי מחדר הלב השמאלי לכיוון אבי העורקים וחותכים את האורקל הימני. לאחר מכן, התחל את הזלוף עם 100 מיליליטר של 0.9% מלח רגיל עד שהדם היוצא מהאורקל הימני ברור. לאחר מכן להמשיך להחדיר עם 250 עד 300 מיליליטר של 4% paraformaldehyde ב 0.1 חיץ פוספט טוחן או PB pH 7.4 במשך 10 דקות.
לאחר הזלוף, הסר את העור של הגפה האחורית הדו-צדדית באמצעות להב כירורגי וחשוף את העצב הסיאטי הדו-צדדי ואת שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי. נתחו את שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי הדו-צדדי בזהירות מהגפה האחורית באמצעות להב והניחו את השריר כולו ב-10 מיליליטרים של 4% פרפורמלדהיד. לאחר שעתיים, הסר את השריר מהתמיסה והגן עליו בהקפאה ב -10 מיליליטר של 25% סוכרוז ב- 0.1 PB טוחן ליום אחד בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר שהרקמה השרירית שקועה בתמיסת הסוכרוז, קבעו אותה בשלב הקפאה של מערכת מיקרוטום הזזה באמצעות מדיום חתך קפוא. פורסים את השריר אופקית לאורך הציר הארוך של השריר בעובי של 80 מיקרון. באמצעות מברשת, מניחים שבעה קטעי קריו לכל באר בצורה מסודרת בצלחת תרבית של שש בארות עם 10 מיליליטרים של 0.1 PB טוחן. לצורך צביעה פלואורסצנטית, יש לדוג ארבעה חלקים לכל באר עם 1.5 מיליליטרים של PB טוחן 0.1 המכיל 75 מיקרוליטרים של 10% Triton X 100 ו-45 מיקרוליטרים של סרום חמור רגיל על שייקר מסלולי ב-20 סל"ד.
לאחר 30 דקות, מעבירים את החלקים ל-1.5 מיליליטרים של תמיסה מעורבת של נוגדנים ראשוניים המכילים נימה אנטי-נוירוגרפית של ארנב 200, טרנספורטר אצטילכולין נגד שלפוחית עזים ב-0.1 PB טוחן, בסרום חמור רגיל של 1%, ו-0.5%Triton X 100 ודגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הקטעים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד ב-0.1 PB טוחן על שייקר מסלולי ב-20 סל"ד. לאחר הדחיפה האחרונה, דגירו את הקטע בתמיסה מעורבת של נוגדנים משניים המכילים חמור נגד ארנב AF 488 וחמור נגד עזים AF 546, כמו גם את הסמנים הביולוגיים של רעלן אלפא בונגארו AF 647 ופאלואידין 350 המכילים 0.1 M PB המכילים 1%נסיוב חמור רגיל ו-0.5 טריטון x 100 למשך שעה, הגנה עליהם מפני אור.
לאחר הדגירה, לשטוף את החלקים ב- PB ולהרכיב אותם על שקופית מיקרוסקופ. יש למרוח את הכיסוי על החלק באמצעות 50% גליצרין במים מזוקקים. שימו לב ודמיינו את הדגימה באמצעות מערכת הדמיה ממוקדת המצוידת בעדשה סובייקטיבית של 20 x עם מפתח צמצם מספרי של 0.75 ועדשה של 40 x עם מפתח צמצם מספרי של 0.95.
להדמיה פלואורסצנטית מרובה, קבעו את אורכי הגל של העירור והפליטה של כל סמן ביולוגי כמתואר בכתב היד של הטקסט. הגדר את הרזולוציה של לכידת תמונה ל- 640 על ידי 640 פיקסלים. לאחר מכן, הגדר את מישור המוקד של ההתחלה והסיום.
הגדר את גודל הצעד למיקרון אחד או שניים. לאחר מכן בחר תבנית עומק, לכידת תמונה וסדרת Z. עבור תמונות ההגדלה הנמוכה יותר ב- 20 X, צלם תמונות ערימה של 40 Z בגודל של שני מיקרון באמצעות חור סיכה של 105 מיקרון.
בחר את מצב ההקרנה או הטופוגרפיה ואת הקרנת העוצמה מעל ציר Z כדי לשלב את כל התמונות במיקוד אחד. עבור תמונות ההגדלה הגבוהה יותר ב- 40 X, צלם תמונות ערימה של 80 Z בגודל צעד מיקרון אחד עם זום המוגדר לשניים וחור סיכה של 105 מיקרון. שלב את כל התמונות במוקד אחד.
שחזרו את התמונות בתבנית התלת-ממדית באמצעות מערכת עיבוד התמונה. המתאם המרחבי הייצוגי של שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי עם נימה עצבית 200 סיבי עצב חיוביים, טרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי חיובי טרום סינפטי, קולטני אצטילכולין חיוביים לרעלן אלפא בונגארו, קולטני אצטילכולין פוסט-סינפטיים חיוביים של אלפא בונגארו, תאי שוואן פריזינפטיים חיוביים S100, סיבי שרירים חיוביים פאלואידין וגרעיני תאיים המסומנים ב- DAPI מודגמים כאן. הנוירופילמנט 200 סיבי עצב חיוביים רץ בצרורות.
סיבי עצב אלה נתנו ענפים למסוע האצטילכולין השלפוחיתי מסופים קדם-סינפטיים חיוביים, שיצרו קשר מראה עם קולטני האצטילכולין החיוביים לרעלן אלפא בונגארו. בנוסף, התאים החיוביים של S100 perisynaptic Schwann זוהו סביב הנוירופילמנט 200 סיבי עצב חיוביים קרוב לטרמינלים הטרום-סינפטיים. המתאם המרחבי הוצג עוד יותר בתבנית תלת-ממדית המציגה את המאפיינים המורפולוגיים המפורטים של הצומת הנוירומוסקולרי מנקודות מבט שונות.
על מנת לצפות בהדמיה רבה יותר במקטעים שריריים, חשוב לפרוס את השריר אופקית לאורך הציר הארוך בעובי של 80 מיקרון.
