이 프로토콜은 정상 및 병리학 적 조건 하에서 신경 근육 접합부의 완전성 및 가소성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 Schwann 세포를 동시에 라벨링하고 단일 근육 섹션에 실험실 동물을 사전 및 게시하는 것입니다. 성인 수컷 쥐를 안락사 한 후, 쥐를 후드에 넣고 흉강을 열어 가위와 포셉을 사용하여 심장에 접근하십시오.
왼쪽 심장 심실에서 대동맥쪽으로 정맥 내 카테터를 삽입하고 오른쪽 오라클을 자릅니다. 다음으로, 오른쪽 신탁에서 나오는 혈액이 맑을 때까지 0.9 % 정상 식염수 100 밀리리터로 관류를 시작하십시오. 그 후 250 내지 300 밀리리터의 4% 파라포름알데히드와 0.1 몰 포스페이트 완충액 또는 PB pH 7.4에서 10분 동안 계속 관류시킨다.
관류 후, 수술 블레이드를 사용하여 양측 뒷다리의 피부를 제거하고 양측 좌골 신경과 내측 위장관 근육을 노출시킵니다. 칼날을 사용하여 뒷다리에서 양측 내측 위장관 근육을 조심스럽게 해부하고 전체 근육을 4 % 파라 포름 알데히드의 10 밀리리터에 접히십시오. 2시간 후, 용액으로부터 근육을 제거하고 섭씨 4도에서 1일 동안 0.1몰 PB의 25%수크로오스 10밀리리터에 냉동보호한다.
일단 근육 조직이 수크로오스 용액에 침지되면, 동결 섹션 배지를 사용하여 슬라이딩 마이크로톰 시스템의 동결 단계 상에 고정시킨다. 근육을 80 미크론 두께로 근육의 긴 축을 따라 수평으로 슬라이스하십시오. 브러시를 사용하여 웰 당 일곱 개의 냉동 섹션을 0.1 몰 PB 10 밀리리터의 여섯 웰 배양 접시에 질서 정연하게 배치하십시오. 형광 염색을 위해, 20 rpm의 오비탈 진탕기 상에서 75 마이크로리터의 10%Triton X 100 및 45 마이크로리터의 정상 당나귀 혈청을 함유하는 0.1몰 PB의 1.5 밀리리터로 웰당 4개의 절편을 인큐베이션한다.
30분 후, 절편을 토끼 항신경 필라멘트 200, 염소 항소포성 아세틸콜린 수송체 중의 0.1몰 PB, 1% 정상 당나귀 혈청, 및 0.5%Triton X 100을 함유하는 1차 항체의 혼합 용액 1.5밀리리터 내로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 인큐베이션한다. 다음날, 절편을 20 rpm의 오비탈 쉐이커에서 0.1 몰 PB로 각각 5분 동안 세 번 세척한다. 마지막 세척 후, 절편을 당나귀 항토끼 AF 488 및 당나귀 항염소 AF 546을 함유하는 이차 항체의 혼합 용액에서 인큐베이션하고, 뿐만 아니라 알파 분가로독소 AF 647 및 팔로이딘 350을 함유하는 바이오마커를 1% 정상 당나귀 혈청 및 0.5 트리톤 x 100을 함유하는 0.1 M PB에 1시간 동안 인큐베이션하고, 빛으로부터 그들을 보호하십시오.
인큐베이션 후, 절편을 PB로 세척하고 현미경 슬라이드에 장착한다. 증류수에 50 % 글리세린을 사용하여 커버 글라스를 섹션에 바르십시오. 수치 조리개가 0.75인 20 x 주관적 렌즈와 0.95의 수치 조리개를 가진 40 x 렌즈가 장착된 con focal 이미징 시스템을 사용하여 시편을 관찰하고 이미지화합니다.
다중 형광 영상화의 경우, 텍스트 원고에 설명된 대로 각 바이오마커의 여기 및 방출 파장을 설정한다. 이미지 캡처의 해상도를 640 x 640 픽셀로 설정합니다. 그런 다음 시작 및 끝 초점면을 설정합니다.
단계 크기를 하나 또는 두 미크론으로 설정합니다. 그런 다음 깊이 패턴, 이미지 캡처 및 Z 시리즈를 선택합니다. 20X에서 낮은 배율 이미지의 경우 105미크론 핀홀을 사용하여 두 미크론 스텝 크기로 40Z 스택 이미지를 캡처합니다.
Z축을 통한 프로젝션 또는 지형 모드와 강도 프로젝션을 선택하여 모든 이미지를 하나의 초점으로 통합합니다. 40X에서 더 높은 배율 이미지의 경우 줌을 두 개로 설정하고 105미크론 핀홀로 설정하여 한 미크론 스텝 크기로 80Z 스택 이미지를 캡처합니다. 모든 이미지를 하나의 초점으로 통합합니다.
이미지 처리 시스템을 사용하여 삼차원 패턴의 이미지를 재구성합니다. 내측 위장관 근육과 신경 필라멘트 200 양성 신경 섬유, 수포성 아세틸콜린 수송체 양성 프리-시냅스 말단, 알파분가로독소 양성 시냅스 후 아세틸콜린 수용체, S100 양성 시냅스 후 슈완 세포, 팔로이드 양성 근육 섬유, 및 DAPI 표지된 세포 핵의 대표적인 공간적 상관관계가 여기에서 입증된다. 뉴로필라멘트 200개의 양성 신경 섬유가 번들로 달렸다.
이들 신경 섬유는 수포성 아세틸콜린 수송체 양성 시냅스 전 말단에 분지를 주었고, 이는 알파 분가로독소 양성 시냅스 후 아세틸콜린 수용체와 거울 관계를 형성하였다. 또한, S100 양성 시냅스 주위 슈완 세포는 시냅스 전 말단에 가까운 뉴로필라멘트 200 양성 신경섬유 주변에서 검출되었다. 공간적 상관관계는 상이한 관점에서 신경근 접합부의 상세한 형태학적 특성을 나타내는 삼차원 패턴으로 추가로 나타내었다.
근육 섹션에서 더 많은 이미징을 관찰하기 위해서는 80 미크론의 두께로 긴 축을 따라 근육을 수평으로 슬라이스하는 것이 중요합니다.
